冷藏蠶豆鮮莢優勢腐敗菌的分離與鑒定

宋居易，張 欣，劉 暢，陳 惠

（江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇 南通 226000）

蠶豆（Vicia fabaL.）系豆科豌豆屬一年生或越年生草本植物，為世界排名第三的食用豆類作物[1]。蠶豆籽粒營養價值很高[2]，江蘇沿江地區及滬、浙等地是我國鮮食蠶豆的重要產地[3]，該地區有食用鮮蠶豆的消費習俗，且市場需求量較大。然而，蠶豆鮮莢的產業受許多因素的制約（如上市時間多集中在5月，氣溫較高，不耐貯藏，貨架期短）而難以進一步發展，故短期內極易形成供大于求的局面，從而致使銷售價格過低[4]，農民增產不增收。如何延長蠶豆鮮莢貨架期，成為鮮食蠶豆產業發展中需待解決的重要問題。

優勢腐敗菌（Dominant spoilage organism,DSO）是指在果蔬采摘、加工、貯藏過程中使其品質劣變起主導作用的微生物[5]。蠶豆鮮莢在收獲后，由于溫度、自身所含酶的作用，以及微生物的快速繁殖、入侵導致腐爛，呼吸和蒸騰作用加劇，并產生纖維化現象，使其食用價值嚴重降低。目前，關于蠶豆鮮莢由于受到貯藏溫度[6-7]和自身所含酶（如多酚氧化酶和過氧化物酶等）[8-11]的作用導致品質劣變的研究較多，但是關于蠶豆鮮莢優勢腐敗菌的研究報道較少。優勢腐敗菌與蠶豆鮮莢貨架期有很大相關性，是其質量監控的重點，因此特定腐敗菌的確定對靶向抑制蠶豆變質和延長其貨架期具有較大意義。

前期試驗顯示，10 ℃下對蠶豆鮮莢進行貯藏保鮮不僅貯藏品質較好，而且成本低。因此，本研究從10 ℃貯藏條件下腐敗的蠶豆鮮莢樣品中分離數量優勢的菌株，通過形態學結合16S rDNA 和內部轉錄間隔區（ITS）測序法進行菌種鑒定，并以菌落總數和蠶豆鮮莢感官評定為評價標準，研究優勢腐敗菌的致腐能力，旨在為蠶豆鮮莢保鮮技術的開發利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

蠶豆鮮莢：由江蘇沿江地區農業科學研究所提供。

牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基，北京索萊寶公司；基因組DNA 提取試劑盒，北京擎科新業生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

LS-30 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DNP-9162 型電熱恒溫培養箱，上海精宏試驗設備有限公司；SCL-1300 型垂直流潔凈工作臺，北京賽伯樂實驗儀器有限公司；CX41 顯微鏡，日本奧林巴斯公司；GB303 電子天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆鮮莢腐敗菌的分離純化

蠶豆鮮莢經低聚乙烯袋包裝后，10 ℃下貯藏直至腐敗，參考潘夢詩等[12]的方法取樣分離菌株，將菌液稀釋到合適的濃度，吸取0.1 mL 涂布于相應菌株篩選培養基上，放入恒溫箱中培養。待菌落長成后，挑選多而不同的菌落，劃線獲得純化的單菌落，4 ℃儲存備用。

1.2.2 腐敗菌的鑒定

采用顯微鏡對篩選的菌株進行初步的形態觀察。采用分子生物學16S rDNA 和ITS 菌種鑒定的方法，對腐敗菌進行鑒定。參照顧春濤等[13]的方法進行DNA提取，回收目標PCR 產物，測序比對，運用Geneious軟件構建系統發育樹。

1.2.3 測定項目與方法

1.2.3.1 腐敗菌致腐能力

在經消毒處理的操作臺上，將分離純化后的各菌株活化后，分別制成適宜濃度的菌液，把蠶豆鮮莢分別浮于其中接種，初始接種量均為104～105CFU/g，處理后的蠶豆鮮莢于10 ℃條件下保存。以未接種腐敗菌的蠶豆鮮莢為對照，以菌落總數和蠶豆鮮莢感官評分為評價標準，研究腐敗菌的致腐能力。

1.2.3.2 菌落總數

參照GB 4789.2—2016[14]中的方法進行測定。

1.2.3.3 感官評定

由6 名有經驗的人員組成感官評定小組。總分在12 分以下表示蠶豆鮮莢開始腐敗，總分9 分以下表示蠶豆鮮莢不可食用。蠶豆鮮莢感官評分標準見表1。

表1 蠶豆鮮莢感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria of fresh pods of broad bean

1.2.4 數據處理

采用SPSS 24.0 軟件對試驗結果進行分析，利用Origin 9.1 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蠶豆鮮莢貯藏過程中腐敗菌的分離結果

由圖1 所示，采用平板劃線法進行分離和純化，共分離出5 株細菌（B1～B5）和2 株真菌（F1～F2）。

圖1 蠶豆鮮莢10 ℃貯藏條件下的腐敗菌Fig.1 Spoilage microorganism in fresh broad bean pods stored at 10 ℃

2.2 腐敗菌的鑒定結果

腐敗菌的菌落形態特征如表2 所示。對5 株細菌進行革蘭氏染色后，發現菌株B1、B2、B3、B4為革蘭氏陰性菌，菌株B5為革蘭氏陽性菌（圖2）。

表2 蠶豆鮮莢腐敗菌的形態學特征Table 2 Morphological characteristics of spoilage organism in fresh broad bean pods

圖2 蠶豆鮮莢5 株細菌（B1～B5）和2 株真菌（F1～F2）顯微形態圖Fig.2 Micromorphology diagram of 5 strains(B1～B5)of bacteria and 2 strains(F1～F2)of fungi in fresh broad bean pods

結合分子生物學方法，對目標菌進行基因組DNA提取、擴增，結果如圖3 所示。5 株細菌在1500 bp 左右均出現穩定、清晰的較強條帶，說明細菌均被成功擴增。真菌F1和F2在250～500 bp 左右出現較強的目標條帶，表明其也被成功擴增。

圖3 蠶豆鮮莢腐敗菌的PCR 產物電泳圖Fig.3 Electrophoretic diagram of PCR products of spoilage organism in fresh pods of broad bean

將上述條帶回收后進行序列測序，通過GenBank中的BLAST 軟件進行比對，獲得與其同源性較高的相似序列，使用Geneious 軟件構建系統發育樹（圖4）。結果顯示：B1與成團泛菌（Pantoea agglomerans），B2與嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），B3與韓國假單胞菌（Pseudomonas koreensis），B4與水生拉恩菌（Rahnella aquatilis），B5與高山芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），F1與 枝 胞 屬 菌Cladosporium xanthochromaticum，F2與球孢白僵菌（Beauveria bas-siana）的親緣關系最近，同源性較高。

圖4 蠶豆鮮莢腐敗菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of spoilage microorganism in fresh broad bean pods

2.3 優勢腐敗菌致腐能力測定結果

如圖5A 所示，冷藏蠶豆鮮莢接種優勢腐敗菌后，菌落總數均隨著貯藏時間的延長呈增加趨勢，對照組增加較為緩慢，貯藏4 d 時，韓國假單胞菌、成團泛菌和嗜麥芽寡養單胞菌菌落總數均已超過蔬菜初期腐敗所規定的6.0（lg（CFU/g））[15]，貯藏至第8 天時，除對照外，其他7 株菌菌落總數均超過標準[15]。貯藏至第10 天時，菌株B3、B1、B2、B4、B5、F1、F2的菌落總數分別達到8.54、8.07、7.74、7.56、7.02、6.88、6.80（lg（CFU/g）），均高于對照組。

由圖5B 可知，接種7 株菌后的蠶豆鮮莢感官評分均隨貯藏時間的延長呈下降趨勢，且均低于對照組。貯藏至第6 天時，接種韓國假單胞菌和成團泛菌的蠶豆鮮莢感官評分分別為7.27 分和8.91 分，蠶豆鮮莢已不可食用；第8 天時，接種不同菌株的蠶豆鮮莢感官評分分別為：嗜麥芽寡養單胞菌7.01 分，水生拉恩菌7.41 分，高山芽孢桿菌8.71 分，枝孢屬菌8.91分，球孢僵白菌8.99 分，均已不可食用；對照組蠶豆鮮莢貯藏至第10 天時，感官評分為9.87 分，已開始腐敗。結合圖5A 中的菌落總數可知，致腐能力較強的腐敗菌為B3、B1、B2和B4，較弱的為B5、F1、F2。

圖5 不同腐敗菌對蠶豆鮮莢菌落總數（A）和感官評分（B）的影響Fig.5 Effect of different dominant spoilage organism on total colony count(A)and sensory score(B)of fresh pods of broad bean

根據貯藏腐敗時的菌落數量優勢和致腐能力較強兩方面確定優勢腐敗菌的原則[16]，最終確定B1菌株（成團泛菌）和B3菌株（韓國假單胞菌）為10 ℃貯藏條件下蠶豆鮮莢的優勢腐敗菌。

3 討論與結論

本試驗分離得到的數量優勢腐敗細菌主要為Pantoea agglomerans、Pseudomonas koreensis、Stenotrophomonas maltophilia、Rahnella aquatilis和Bacillus altitudinis。腸桿菌科在新鮮農產品中含量豐富[17]，成團泛菌為腸桿科菌中的一員，其為新鮮綠豆芽、菠菜和胡椒微生物群的主要成員[18]。Keshria 等[19]在對綠豆芽腐敗菌的研究中發現，假單胞菌屬、泛菌屬細菌是其優勢腐敗菌。假單胞菌屬是在土壤中發現的一種高度異質性的腐生菌，其包括人類和動植物的條件致病菌、有機物及植被分解者[20-21]。有研究表明[22]，假單胞菌屬成員在蘿卜芽、苜蓿、綠豆和西蘭花芽中含量豐富，如熒光假單胞菌和黃綠假單胞菌[23]。嗜麥芽窄食單胞菌、芽孢桿菌屬和拉恩氏菌屬在其他研究中也是優勢腐敗菌[24-26]。而在其他一些研究中，腸桿科菌中的歐文氏菌屬是主要的優勢腐敗菌[27-29]。本試驗分離得到的數量優勢腐敗真菌為Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。Cladosporium xanthochromaticum在某些食物中也是常見的優勢腐敗菌[30]。

由于在冷藏條件下，細菌比真菌容易生長，更容易成為優勢菌，所以細菌比真菌更易導致冷藏新鮮蔬菜和瓜果的采后腐敗[30]。本試驗結果表明，韓國假單胞菌和成團泛菌是冷藏蠶豆鮮莢的優勢腐敗菌。韓國假單胞菌和成團泛菌腐敗能力強可能是因為以下兩個原因：①它們可以產生過氧化氫酶、氧化酶（大多數）和催化蛋白質水解和脂解反應的酶，從而導致冷藏新鮮產品的腐敗[31]；②它們可以攻破植物防御機制[32]，利用植物營養素，如果膠酶、聚半乳糖醛酸酶（PG）和果膠甲酯酶（PME）等對植物果膠進行降解、液化，進而導致植物腐爛。植物組織遭到破壞后，導致更多的細菌和真菌進入，從而加快和加重腐敗。

本研究從在10 ℃條件下放置腐敗的蠶豆鮮莢表面分離得到的數量優勢腐敗菌為Pantoea agglomerans、Stenotrophomonas maltophilia、Pseudomonas koreensis、Rahnella aquatilis、Bacillus altitudinis、Cladosporium xanthochromaticum和Beauveria bassiana。對蠶豆鮮莢的致腐能力大小排序為Pseudomonas koreensis＞Pantoea agglomerans＞Stenotrophomonas maltophilia＞Rahnella aquatilis＞Bacillus altitudinis＞Cladosporium xanthochromaticum＞Beauveria bassiana。Pseudomonas koreensis和Pantoea agglomerans為10 ℃貯藏條件下蠶豆鮮莢的特定優勢腐敗菌。以上結果可為蠶豆鮮莢生物保鮮技術的研究提供理論依據。