肥料中12種植物生長調(diào)節(jié)劑測定方法研究

王小雨，馬小東，吳 凡

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

植物生長調(diào)節(jié)劑是人工合成的（或從微生物中提取的）具有和天然植物激素相似生長發(fā)育調(diào)節(jié)作用的有機化合物［1-2］。我國從20世紀50年代開始生產(chǎn)和應(yīng)用植物生長調(diào)節(jié)劑，近50 年來人工合成的植物生長調(diào)節(jié)劑越來越多。我國對植物生長調(diào)節(jié)劑按照農(nóng)藥登記的要求進行管理，按照登記批準(zhǔn)標(biāo)簽上標(biāo)明的使用劑量、時期和方法使用植物生長調(diào)節(jié)劑一般不會危害人體健康。但如果使用不規(guī)范，也可能會造成農(nóng)作物生長過快，或生長受到抑制，甚至死亡，從而影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。例如可以延長馬鈴薯、大蒜和洋蔥等農(nóng)產(chǎn)品貯藏期的青鮮素（抑制發(fā)芽）具有致癌作用。所以我國法律明文禁止銷售、使用未經(jīng)國家或省級有關(guān)部門批準(zhǔn)的植物生長調(diào)節(jié)劑。若在肥料中添加植物生長調(diào)節(jié)劑，應(yīng)與藥肥的登記方式相同，即按照農(nóng)藥進行登記，但由于農(nóng)藥登記時間長、費用高，近年來一些不法廠商在肥料中違禁添加植物生長調(diào)節(jié)劑的現(xiàn)象屢見不鮮，影響肥料行業(yè)的健康發(fā)展。

目前行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對于植物生長調(diào)節(jié)劑的測定多為單一物質(zhì)檢測方法，而國家標(biāo)準(zhǔn)尚未對植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法做出規(guī)定。已有標(biāo)準(zhǔn)和文獻中測定肥料中植物生長調(diào)節(jié)劑的常見方法為高效液相色譜法［3-7］，涵蓋的植物生長調(diào)節(jié)劑種類不夠多，同時高效液相色譜法一般采用紫外或者熒光檢測器，存在樣品前處理相對復(fù)雜、靈敏度不高、分離度不好等問題，而液相色譜串聯(lián)三重四極桿檢測器方法［8］，樣品前處理簡單，干擾少，靈敏度高，質(zhì)譜響應(yīng)可達10-9甚至10-12的水平。

綜上所述，為了提高測定準(zhǔn)確度和檢測效率，筆者通過篩選色譜柱、改變梯度洗脫程序、考察基質(zhì)效應(yīng)等方式優(yōu)化實驗條件，并驗證方法學(xué)數(shù)據(jù)，建立了超聲提取-液相色譜串聯(lián)三重四極桿（LCQQQ）同時測定4-硝基苯酚鈉（PG-1）、5-硝基鄰甲氧基苯酚鈉（PG-2）、萘乙酸（PG-3）、脫落酸（PG-4）、赤霉酸（PG-5）、2,4D（PG-6）、吲哚-3-乙酸（PG-7）、吲哚丁酸（PG-8）、氯吡脲（PG-9）、烯效唑（PG-10）、多效唑（PG-11）、6-芐氨基嘌呤（PG-12）12種植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法。方法簡單快捷、準(zhǔn)確高效，為肥料中植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測和市場監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

SCIEX3500Q 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國SCIEX 公司），配有TRIPLE QUADTM3500 質(zhì)譜、ekspertTMultraLC 110 液相色譜、MultiQuantTM3.0.1 Software數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；色譜柱1，Eclipse Plus C18（美國安捷倫科技有限公司），5 μm，4.6 mm×150.0 mm；色譜柱2，ACQUITY UPOLC? BEH C18（沃特世公司），1.7 μm，2.1 mm×100.0 mm；離心機（德國SIGMA 公司）；BSA224S 型萬分之一天平（德國Sartorius公司）；移液槍（德國艾本德股份公司），0.5 ～10.0、10 ～200、50 ～500、100 ～1 000 μL。

1.2 主要材料與試劑

PG-1至PG-12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（998.7 ～1 001.6 mg/L，規(guī)格1 mL），德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇，色譜純，上海泰坦科技股份有限公司；甲酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

正離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：在10 mL帶橡膠墊的廣口玻璃瓶中加入甲醇9 920 μL，使用移液槍分別移取10 μL PG-1 至PG-8，得到質(zhì)量濃度約為1 μg/mL的正離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

負離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備：在10 mL帶橡膠墊的廣口玻璃瓶中加入甲醇9 960 μL，使用移液槍分別移取10 μL PG-9至PG-12，得到質(zhì)量濃度約為1 μg/mL的負離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

負離子標(biāo)準(zhǔn)中間液的制備：在10 mL帶橡膠墊的廣口玻璃瓶中加入甲醇9 000 μL，使用移液槍移取1 000 μL負離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到質(zhì)量濃度約為0.1 μg/mL的負離子標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

用甲醇稀釋正離子標(biāo)準(zhǔn)儲備液和負離子標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成PG-1 至PG-8 質(zhì)量濃度為50、100、200、500、1 000 ng/mL，PG-9 至PG-12 質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 儀器工作條件

2.1 色譜條件

進樣量為5 μL；柱溫為40 ℃；流動相為體積分數(shù)0.1%的甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；流速為0.8 mL/min。采用梯度洗脫，洗脫程序為0 ～1.5 min時，φ（B）為10%；1.5 ～3.0 min，φ（B）由10%增至60%；3.0 ～7.5 min 時，φ（B）由60%增至90%；7.5 ～9.0 min 時，φ（B）由90%降至10%；9.0 ～15.0 min時，φ（B）為10%。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）溫度550 ℃。正、負離子模式下氣簾氣壓強分別為0.31、0.07 MPa，離子化電壓（IS）分別為+5 500 V、-4 500 V，入口電壓分別為10 V、-10 V，碰撞出口電壓（CXP）分別為6 V、-6 V，噴霧氣壓強分別為0.48、0.48 MPa；輔助加熱氣壓強分別為0.48、0.48 MPa；噴撞氣壓強分別為0.07、0.06 MPa；質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.3 樣品溶液制備

稱取肥料樣品0.1 ～0.3 g（精確至0.1 mg）于離心管中，準(zhǔn)確加入甲醇25 mL，渦旋1 min，于25 ℃超聲波清洗器中超聲30 min，6 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm有機相濾膜，上機檢測。

3 實驗結(jié)果

3.1 色譜柱和梯度洗脫

分別采用色譜柱1 和色譜柱2 測試正離子和負離子模式下12種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰情況。使用色譜柱1分析正離子質(zhì)量濃度為100 ng/mL，負離子質(zhì)量濃度為10 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進樣體積為10、5、2 μL 時，雖然隨著進樣量減少，正離子定量離子對的峰逐漸尖銳，但始終檢測不到（347.5 kg/C）/（193.0 kg/C）、（347.5 kg/C）/（221.0 kg/C）的離子對，為了排除儀器檢出限的影響，直接使用正離子質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL、負離子質(zhì)量濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測定，依然檢測不到（347.5 kg/C）/（193.0 kg/C）、（347.5 kg/C）（221.0 kg/C）的離子對信號。負離子模式下，PG-9、PG-10、PG-11、PG-12 的離子峰隨著進樣量減少，鈍化趨勢減弱，但始終得不到平滑、尖銳、對稱的峰。

使用色譜柱2分析正離子質(zhì)量濃度為100 ng/mL，負離子質(zhì)量濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時，考察流動相A的初始體積分數(shù)由10%調(diào)整至90%，12種物質(zhì)的出峰保留時間逐漸后移，在如2.1節(jié)所示的梯度洗脫條件時，得到了理想的總離子流圖。每種物質(zhì)實現(xiàn)了基線分離，展寬小，峰形尖銳，對稱性好。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以不移動的方式（4 ℃的自動進樣器中）保存，分別在2021 年12 月8 日、2021 年12 月13 日、2021 年12 月16 日 進 行 測 試，以PG-1（4-硝基苯酚鈉）為例，峰面積、標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距與斜率都沒有發(fā)生明顯變化，證明7 d 內(nèi)低溫保存可以保證標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度水平的穩(wěn)定，結(jié)果見表2、表3。另外11種物質(zhì)與PG-1的趨勢一致。

表2 不同保存日期下PG-1線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表3 不同保存日期下PG-1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積

3.3 空白和干擾

為排除試劑和樣品基體引入的干擾，在標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相同條件下測甲醇試劑、去離子水及體積分數(shù)0.1%的甲酸水溶液的離子流圖，幾種試劑在目標(biāo)物質(zhì)的保留時間沒有實質(zhì)響應(yīng)信號，對實驗結(jié)果并不產(chǎn)生干擾。使用不含有待測物質(zhì)的空白樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)（避開標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度水平）由低到高選取4個均勻分布的濃度水平進行加標(biāo)回收實驗，平行測定2 次，結(jié)果見表4，加標(biāo)回收率在91.15%～116.84%，說明樣品的基質(zhì)效應(yīng)很弱。

表4 空白樣品加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別以12 種植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程（見表5）。以最低水平標(biāo)準(zhǔn)溶液3 倍信噪比和10 倍信噪比確定各化合物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果表明，12 種植物生長調(diào)節(jié)劑線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.998 3，方法線性良好，滿足檢測要求。

表5 線性回歸方程

3.5 精密度和回收率

對含12 種植物生長調(diào)節(jié)劑的肥料樣品，在與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相同測定條件下進行了8 次平行測定，考察實驗方法和儀器設(shè)備的穩(wěn)定程度，實驗結(jié)果見表6。由表6 可知，該方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.55%～8.98%。考察了該肥料樣品3個濃度水平的加標(biāo)回收率，每個樣品平行測定2次，結(jié)果見表7。由表7 可知，樣品的回收率在90.67% ～114.57%，滿足檢測需求。

表6 精密度實驗結(jié)果（n=8）

表7 樣品加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

3.6 樣品分析

使用建立的超聲提取-液相色譜串聯(lián)三重四級桿方法對尿素、有機-無機復(fù)混肥、生物有機肥、硫酸銨、氯化鉀、有機肥料6類肥料的24個典型樣品（每類4 個）中植物生長調(diào)節(jié)劑含量進行了測定。在有機肥料中檢測到了4-硝基苯酚鈉，質(zhì)量濃度約為204.25 ng/mL，其他樣品中12種目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度均小于方法的定量限水平。說明流通領(lǐng)域的肥料樣品對于植物生長調(diào)節(jié)劑的使用是比較安全的，沒有出現(xiàn)隨意使用的情況。

4 結(jié)論

建立了一種超聲提取-液相色譜串聯(lián)三重四極桿同時測定肥料中12 種植物生長調(diào)節(jié)劑的方法：與色譜柱1 相比，色譜柱2 在規(guī)定的儀器工作條件下更容易得到平滑、對稱、尖銳的色譜峰；肥料本身的化學(xué)組成在2.3 節(jié)的處理條件下基質(zhì)效應(yīng)不足以對測定結(jié)果產(chǎn)生實質(zhì)影響；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在4 ℃條件下比較穩(wěn)定，7 d 內(nèi)同一工作溶液響應(yīng)信號無明顯下降；方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、精密度、回收率等方法學(xué)數(shù)據(jù)表現(xiàn)良好，能夠滿足肥料中植物生長調(diào)節(jié)劑的日常檢測需求，為肥料中植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測及市場監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。