難治性Graves病患者外周血免疫學特征分析

胡詩倩 何明倩 陳子怡 王悅

Graves病（Graves'disease,GD）是常見的器官特異性自身免疫性疾病，在遺傳、環境和表觀遺傳等多種因素作用下，機體產生促甲狀腺素受體自身抗體（thyrotropin receptor antibody,TRAb），CD4+T細胞在此過程中發揮了關鍵作用。GD主要表現為甲狀腺毒癥，可引起全身各系統的損害。目前抗甲狀腺藥物是GD患者的一線治療方案。但是正規藥物治療后，僅有40%～50%的患者可獲得長期緩解[1-2]，部分難治性GD患者盡管規律治療5年以上，但TRAb持續陽性或甲狀腺功能指標持續異常。目前，難治性GD的確切發病機制尚未完全闡明。因此，本研究通過比較難治性及緩解期GD患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）基因表達的差異，外周血CD4+T細胞亞群[Th17和調節性T細胞（regulatory T cell,Treg）]比例，以及下游相關細胞因子水平，探討難治性GD可能的免疫學發病機制，為難治性GD的治療提供新靶點，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2018年12月至2021年2月于西安交通大學第一附屬醫院內分泌科門診就診的難治性GD患者27例（難治性GD組），其中男4例，女23例，年齡20～52（37.7±9.1）歲；TRAb水平（33.1±8.6）U/L；甲狀腺功能亢進1例（3.7%），亞臨床甲狀腺功能亢進26例（96.3%）。選擇同期年齡、性別相匹配的緩解期GD患者25例（緩解期GD組），其中男2例，女23例，年齡20～65（38.6±12.0）歲；TRAb水平（4.7±1.5）U/L；甲狀腺功能均正常。兩組患者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），TRAb水平及甲狀腺功能比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。納入標準：（1）難治性GD患者[3-5]：根據臨床表現及相關輔助檢查確診為GD，抗甲狀腺藥物治療5年以上，TRAb持續陽性，或甲狀腺功能指標持續異常的患者；（2）緩解期GD患者：根據臨床表現及相關輔助檢查確診為GD，抗甲狀腺藥物停藥1年以上，甲狀腺功能正常且TRAb陰性的GD患者。排除標準：（1）有其他自身免疫性疾病，感染性疾病，嚴重心、肝、腎疾病，或惡性腫瘤的患者；（2）正在使用免疫調節劑的患者。本研究已通過西安交通大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審批（批準文號：XJTU1AF2016LSK-35），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及主要試劑、儀器 所有患者抽取空腹靜脈血，用無菌EDTA抗凝管收集，部分血樣用于轉錄組測序及流式細胞分析，其余血樣離心取血漿分裝后-80℃儲存備用。淋巴細胞分離液為美國Sigma-Aldrich公司產品，Trizol RNA分離試劑、SuperScript dscDNA合成試劑盒均為美國Invitrogen公司產品，Cell stimulation cocktail為美國eBioscienc公司產品，FITC小鼠抗人CD3抗體、FITC小鼠抗人CD4抗體、APC小鼠抗人CD8抗體、Fixation/Permeabilization試劑盒、Stain‐ing Buffer均為美國BD Pharmingen公司產品，APC小鼠抗人CD25抗體、PE小鼠抗人Foxp3抗體、PE小鼠抗人IL-17A抗體、PE小鼠IgG1均為美國eBioscience公司產品；人TRAb放射受體分析試劑盒為天津市協和醫藥科技有限公司產品；Luminex液相懸浮芯片為上海華盈生物醫藥科技有限公司產品；人TGF-β1 ELISA試劑盒為美國Raybiotech公司產品；FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司產品；Luminex 200檢測儀為美國Luminex Corporation公司產品；Illumina HiSeq 3000測序儀為美國Illumina公司產品。

1.2.2 TRAb檢測 采用放射受體分析法。根據人TRAb放射受體分析試劑盒說明書步驟進行，檢測范圍為0～405 U/L，正常參考范圍為＜9 U/L。

1.2.3 轉錄組測序及數據分析 采用密度梯度離心法提取外周血PBMC，加入Trizol溶解后抽提mRNA。mRNA擴增后用片段緩沖液將其裂解為300 bp的片段。然后，將這些片段作為模板，根據說明書步驟使用SuperScript dscDNA合成試劑盒合成dscDNA。制備的dscDNA文庫經純化、富集、評估后，用Illumina HiSeq 3000測序儀進行測序。原始測序數據去除低質量堿基和適配器序列，用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（FPKM）值計算基因表達量。采用DE‐Seq2包鑒定文庫之間的差異表達基因，差異倍數（fold change,FC）≥2，即|log2FC|≥1和錯誤發現率（false dis‐covery rate,FDR）＜0.05的基因被認為具有顯著性。使用ggplot2包繪制火山圖。使用“clusterProfiler”R包進行基因本體論（gene ontology,GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and ge‐nomes,KEGG）富集分析，判定其主要影響的生物學功能及信號通路，設定P＜0.05為閾值。

1.2.4 Th17細胞比例檢測 采用流式細胞術。調節PBMC 濃度至 2×106/ml，取 500 μl置于 EP管中；加入2 μl cell stimulation cocktail，37 ℃、5% CO2培養箱培養6 h；用staining buffer洗滌2次；重懸后取100 μl，加入10 μl CD3 FITC 和 10 μl CD8 APC，室溫避光孵育30 min；洗滌2次后加入1 ml 1×Fix/Perm液，4℃避光孵育 45 min；洗滌 2次、用 100 μl 1×Perm/wash buffer重懸后加入5 μl IL-17A PE，室溫避光孵育45 min；洗滌、重懸、上機檢測。結果以CD3+CD8-IL-17A+的T細胞數占CD4+T細胞數的百分比表示。

1.2.5 Treg細胞比例檢測 采用流式細胞術，密度梯度離心法提取PBMC，重懸后計數，調節細胞濃度至1×106/ml，取 100 μl置于 EP 管中，加入 10 μl CD4 FITC 和 5 μl CD25 APC，室溫避光孵育 30 min；用staining buffer洗滌2次；加入1 ml 1×Fix/Perm破膜固定液，4℃避光孵育45 min；用1×Perm/wash buffer洗滌2次；重懸加入5 μl Foxp3 PE，室溫避光孵育45 min；再次洗滌、重懸、上機檢測。結果以CD4+CD25+Foxp3+的T細胞數占CD4+T細胞數的百分比表示。Th17/Treg比值為CD3+CD8-IL-17A+的T細胞數和CD4+CD25+Foxp3+的T細胞數的比值。

1.2.6 細胞因子檢測 采用Luminex液相懸浮芯片技術。按說明書要求準備好血漿樣品、Serum Matrix、標準品、參照品，按照既定順序上樣；96孔板中每孔加入25 μl微珠、25 μl樣品和 25 μl Assay Buffer；取 50 μl準備好的稀釋標曲、Blank和參照品Control加入對應孔中，將96孔板貼上封口膜，850 r/min振蕩、4℃避光過夜孵育；棄去每孔中的樣品，洗滌3次；每孔中加入50 μl Detection Antibody，貼上封口膜，850 r/min振蕩、室溫避光孵育1 h；每孔加入50 μl Streptavidin-PE，貼上封口膜，850 r/min振蕩、室溫避光孵育30 min；洗滌3次；每孔中加入150 μl Sheath Fluid重懸微珠，貼上封口膜，850 r/min室溫避光振蕩5 min；將96孔板放入校正好的Luminex 200檢測儀中讀值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件、FlowJo軟件和GraphPad Prism 8軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者PBMC轉錄組測序分析 相較于緩解期GD組患者，難治性組GD患者PBMC中共篩選出265個顯著性差異表達基因，其中45個基因表達下調，211個基因表達上調，見圖1a（插頁）。KEGG富集分析顯示，難治性GD組患者PBMC中上調的差異基因主要在cytokine-cytokine receptor interaction、IL-17 signaling、NF-κB signaling、MAPK signaling、Th17 cell differentiation等與Th17細胞分化及下游效應細胞因子作用相關的信號通路富集，見圖1b（插頁）。GO分析顯示，上調的差異基因參與了cell chemotaxis、positive regulation of acute inflammatory response、leukocyte che‐motaxis等與炎癥和趨化相關的生物學過程，主要影響cytokine activity、cytokine receptor binding、receptor li‐gand activity、chemokine activity、chemokine receptor binding等分子功能，見圖1c、d（插頁）。

圖1 兩組患者PBMC轉錄組測序分析

2.2 兩組患者外周血Th17、Treg細胞比例分析 難治性GD組外周血中Th17細胞比例高于緩解期GD組，而Treg細胞比例低于緩解期GD組，Th17/Treg比值也高于緩解期GD組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2-4。

圖2 兩組患者外周血Th17細胞流式分析圖比較

圖3 兩組患者外周血Treg細胞流式分析圖比較

圖4 兩組患者外周血Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值比較

2.3 兩組GD患者血漿相關細胞因子水平比較 相較于緩解期GD組患者，難治性GD組患者外周血中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IL-1β 及 IL-10的表達水平均增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；但IL-23和TNF-α表達差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組GD患者血漿相關細胞因子水平比較（pg/ml）

3 討論

目前難治性GD的確切發病機制尚未完全闡明。本研究通過轉錄組測序技術篩選了難治性和緩解期GD患者PBMC中顯著性變化的差異表達基因。通過KEGG富集分析發現，難治性GD患者PBMC中表達顯著上調的基因,主要在與Th17細胞分化及其效應細胞因子IL-17作用相關的信號通路富集。GO分析顯示，難治性GD患者表達上調的基因主要通過影響細胞因子、趨化因子的分子功能，參與了炎癥和趨化相關的生物學過程。以上結果提示，Th17細胞的過度分化及其下游效應因子的功能紊亂可能與GD的難治性密切相關。

既往研究表明，T淋巴細胞是自身免疫性甲狀腺疾病發病的重要參與因素[1]。Th17是CD4+T細胞的一種，其主要效應因子IL-17與受體結合后可以激活下游MAPK和NF-κB等炎癥信號轉導通路，促進炎癥因子、趨化因子以及黏附分子的大量分泌，參與多種炎癥反應和自身免疫疾病的發生、發展。相反，Treg細胞是維持外周免疫耐受和機體免疫平衡的關鍵性CD4+T細胞亞群[6]。事實上，Th17細胞和Treg細胞分化都需要TGF-β介導的信號通路來起始，在IL-6或IL-21同時存在的條件下，原始CD4+T細胞分化為Th17細胞；而在缺乏促炎細胞因子的情況下，TGF-β則促使其分化成Treg細胞[7]。現在越來越多的證據表明Th17、Treg細胞失衡在類風濕性關節炎、銀屑病、多發性硬化和炎癥性腸病等多種自身免疫性疾病中起著至關重要的作用[8-10]。但是，目前Th17、Treg細胞平衡與難治性GD關系的研究甚少。因此，本研究進一步檢測了難治性和緩解期GD患者外周血中Th17和Treg細胞比例。結果顯示，相較于緩解期GD組，難治性GD組患者外周血中Th17細胞比例升高，而Treg細胞比例降低，Th17/Treg比值也增高，說明Th17、Treg的平衡失調與GD的難治性密切相關。

本研究進一步檢測了難治性和緩解期GD患者血漿中相關下游效應細胞因子的表達水平。結果顯示，難治性GD組血漿中IL-17A、IL-6、TGF-β1、IL-1β及IL-10的表達水平高于緩解期GD組。IL-17A是Th17細胞最主要的效應因子，之前的細胞實驗發現，甲狀腺組織中存在功能性IL-17受體的表達，IL-17A與其結合可以促進甲狀腺細胞合成和分泌IL-6以及其他趨化因子、細胞間黏附因子[5]。此外，IL-17A還可以促進前體樹突狀細胞的分化和成熟，從而持續刺激T細胞活化增殖，產生IL-4、IL-10等細胞因子促進B細胞成熟并分泌自身抗體。同時在對類風濕性關節炎等慢性炎癥疾病的研究中發現，IL-17A可以促進炎性細胞的活化，并誘導IL-1β等炎性細胞因子的釋放。IL-6具有刺激B細胞活化產生自身抗體、促進T細胞增殖以及細胞毒性T淋巴細胞活化等多重免疫調節功能。之前的研究發現，IL-17和TRAb均可促進甲狀腺細胞合成分泌IL-6，而IL-6可以進一步刺激B細胞分化成熟,增加甲狀腺自身抗體的產生[5,11]。此外，IL-6還能與TGF-β一起誘導Th17細胞的分化，從而形成正反饋調節，加劇甲狀腺局部的自身免疫炎癥反應。早期有研究發現，難治性GD患者血清中IL-10的表達水平顯著增高[12]。IL-10可以刺激IgG向IgG3亞型的轉換[13]，而多因素logistic回歸分析顯示，血清IgG3/IgG比值是難治性GD的獨立影響因素[14]。基因研究發現，難治性GD患者IL-1β基因-31位點的T等位基因攜帶頻率顯著高于緩解期GD患者，該等位基因攜帶者IL-1β合成增加[15]，而IL-1β又可以促進Th17細胞的分化和增殖，形成正反饋調節。

綜上所述，增高的IL-17A可以促進IL-6、IL-1β以及IL-10等細胞因子的表達，筆者推測這些因子之間可能通過相互作用，形成一個多效性的功能網絡，或通過刺激B細胞分化成熟,進一步增加甲狀腺內自身抗體的產生；或增強其他炎性細胞因子的功能，誘導持續的自身免疫反應；或能反過來促進Th17細胞的分化和增殖，形成正反饋調節，誘導甲狀腺局部持續的自身免疫炎性反應，從而導致難治性GD的發生。因此，Th17、Treg平衡失調以及下游相關效應細胞因子的免疫紊亂與GD的難治性密切相關，Th17、Treg細胞平衡可能是難治性GD免疫治療的新型有效靶點。