蒙古沙冬青AmRD22基因的克隆及耐逆功能研究

張 敏，王學峰，馬 利，劉佳杰，張慧玲，王茅雁

(內蒙古農業大學 生命科學學院，呼和浩特 010018)

土壤鹽漬化和干旱嚴重影響植物的生長發育和產量及品質，成為影響全球農業生產的主要非生物脅迫。植物在演化過程中形成了復雜的機制來應對這些逆境脅迫，其中耐逆基因的表達是形成復雜耐逆機制的遺傳基礎[1]。目前已從許多植物中鑒定出大量耐逆相關基因，其中脫水應答蛋白22(responsive to dehydration protein 22，RD22)類基因與植物的耐鹽性和耐旱性密切相關，成為重要候選耐逆基因。

RD22s屬于植物特有的BURP(取自最初4個成員BNM2、USP、RD22和PG1β的首字母)蛋白家族中的一個亞族[2]。至今已相繼從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等許多植物中克隆或發現其編碼基因[3-8]，并對部分基因的功能進行了研究。序列分析表明，大多數RD22蛋白從N端至C端由4部分組成，即短疏水區(多為信號肽)、短保守區、含TXV重復單元的可變區和長而保守的BURP結構域[3-5,9-11]，其中多數蛋白如大豆GmRD22、陸地棉(Gossypiumhirsutum)GhRDL1和擬南芥AtRD22等定位于細胞壁或質外體[9-11]，個別如咖啡(Coffeaarabica)CaBDP1定位于內質網[12]。

目前對于RD22類基因的生理功能所知不多。AtRD22的表達受脫水、鹽脅迫和外源脫落酸(abscisic acid, ABA)誘導，此過程需ABA信號通路轉錄激活因子AtMYC2/rd22BP1和AtMYB2的合成與調節[3,13-14]，其突變體的耐旱性增強[15]。AtRD22還受Cu2+脅迫的誘導，其編碼蛋白可與Cu2+結合并在抵抗Cu2+脅迫中起重要作用[16-17]。紫桿檉柳(Tamarixandrossowii)Tard22、多枝檉柳(T.ramosissima)Trrd22和葡萄(Vitisvinifera)VvRD22a/VvRD22的表達受鹽和/或干旱脅迫的誘導，轉入煙草(Nicotianabenthamiana)可提高耐鹽性和/或耐堿性[7,18-21]。大豆Gm06.2/GmRD22的啟動子區含ABA應答元件ABRE(ABA responsive element)，其表達對ABA、鹽和滲透脅迫有明顯響應，轉入擬南芥或水稻(Oryzasativa)可提高木質素含量和耐鹽性及耐旱性[6,9]。咖啡CaBDP1的表達被干旱、鹽和低溫脅迫抑制而下調，但受ABA誘導，其轉基因擬南芥的耐鹽性降低、ABA敏感性增強[12]。其他RD22基因中有許多在干旱、鹽和/或低溫脅迫下表達量上調，其中又有多數基因，如油菜(Brassicanapus)BnBDC1、鹽穗木(Halostachyscaspica)HcRd22和小麥(Triticumaestivum)TaBURP3D等的表達受外源ABA調節，可能通過依賴于ABA的信號途徑發揮功能[4,22-23]，但它們在抵抗逆境和ABA脅迫中的具體作用未見報道。有少數RD22基因主要參與生長發育過程，如陸地棉GhRDL1/GhRD4在伸長的棉纖維細胞中高表達，其編碼蛋白通過與細胞壁伸展蛋白GhEXPA1互作而使細胞壁松弛，從而促進轉基因擬南芥和棉花的生長并使其明顯增產[10]。最近報道該基因對鹽、熱和滲透脅迫及ABA均有響應[24]。

蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)是豆科沙冬青屬的一個種，為古老的珍稀瀕危常綠闊葉強旱生灌木，主要分布于中國西北干旱荒漠區，具有很強的耐寒、耐旱和耐鹽堿特性[25]。前期通過構建cDNA文庫從該物種獲得一段RD22基因的cDNA序列，命名為AmRD22。本研究對該基因進行了克隆、表達分析和轉基因功能鑒定，為其耐逆功能和作用機理研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

蒙古沙冬青種子由內蒙古巴彥淖爾市磴口縣林業局提供，野生型擬南芥(哥倫比亞0型)種子、植物表達載體pCOMBIA3301(p3301)、大腸桿菌(E.coli)菌株DH5α和根癌農桿菌菌株GV3101由本實驗室保存。

1.1.1 野外取樣蒙古沙冬青野外植株的嫩葉采自內蒙古蒙草抗旱股份有限公司野生植物園區的成年植株，地點位于呼和浩特市南郊，取樣于2013年7月-2014年5月按月進行。

1.1.2 脅迫處理將蒙古沙冬青種子用1.0%的次氯酸鈉溶液滅菌15 min，用滅菌水漂洗5次，置于鋪有濾紙、加適量滅菌水的培養皿中，于25 ℃催芽4 d。將萌發的種子移栽到河沙土中，于25 ℃、每天16 h光照和8 h黑暗下培養2個月，然后對幼苗進行不同脅迫處理：(1)干燥失水。從培養盆中取出幼苗并用自來水漂洗干凈，置于25 ℃下自然干燥；(2)鹽脅迫。用300 mmol/L的NaCl溶液澆幼苗一次；(3)低溫。將盆栽苗放入低溫光照培養箱(BD-PRX-1000A，下同)中進行4 ℃/12 h、0 ℃/10 h和-6 ℃/2 h的連續降溫處理；(4)ABA處理。從培養盆中取出幼苗并用自來水漂洗干凈，先浸根于1×MS大量元素培養液中24 h(預處理)，再浸根于含100 μmol/L ABA的1×MS大量元素培養液中，用小氣泵通氣。

4種處理均在處理前(0 h，對照)和處理開始后1、3、8和24 h各取5株幼苗為樣品，其中鹽和低溫處理分別用室溫和4 ℃預冷的自來水漂洗根部沙土。所有樣品用液氮速凍后保存于-76 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆以AmRD22部分序列(852 bp，5′端不完整)為模板設計引物5′-GTTTCTTTGTCTACTTCAGTGGATAC-3′(outer)和5′-CTTTT-CCTCACCTCTAATGCCAG-3′(inner)，利用TaKaRa公司5′-RACE試劑盒進行5′-RACE反應，獲得其5′端序列并與原序列拼接，得到其全長cDNA序列。在此序列的編碼區兩側設計引物5′-AAAGATCTACCTCTACCACCACCAAG-3′(上游，加BglⅡ切點)和5′-GTGGTCACCTAAATCTACTTGGGAAC-3′(下游，加BstEⅡ切點)，以蒙古沙冬青低溫脅迫全長cDNA文庫[26]為模板進行PCR。將擴增片段與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接并用熱激法轉化E.coliDH5α，經菌落PCR檢測獲得陽性克隆，送北京華大基因公司測序。

1.2.2 蛋白序列分析利用DNAMAN軟件預測分子量和等電點；利用Myhits SIB Motif Scan(https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)檢索BURP結構域；利用SignalP 5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)分析信號肽；利用Plant-mPLoc server 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/plant-multi/)預測亞細胞定位；利用MEGA7.0軟件通過鄰接法構建進化樹，均采用默認參數。

1.2.3 基因表達分析用Trizol法從-76 ℃凍存樣品中提取總RNA，經DNase(TaKaRa公司)純化后用M-MLV逆轉錄酶(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈，以蒙古沙冬青AmActin作為內參基因(5′-TGTTTCCGGGTATTGCTGAC-3′和5′-ACCCAGAGCCATCAAATAAG-3′)，用AmRD22特異引物5′-TGTGCCTTTGGAAGGTGCGG-3′和5′-TCTACTTGGGAACCCAGACAACG-3′進行RT-PCR。反應體系中含10×EasyTaq酶緩沖液1.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L each)1.2 μL、上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)、EasyTaq酶(5 U/μL，北京全式金生物技術有限公司)0.15 μL，cDNA模板(稀釋10倍)經內參基因均一化而定，用ddH2O補足至15 μL。PCR程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。產物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，利用Image J軟件掃描膠圖得出灰度值，計算處理樣品相對于其對照樣品(灰度值為1)的變化倍數。實驗重復3次。

1.2.4 表達載體構建及轉化擬南芥用質粒小提試劑盒(天根生物公司)提取克隆載體pMD19-AmRD22和植物表達載體p3301 DNA，用BglⅡ和BstEⅡ(TaKaRa公司)進行雙酶切。將酶切產物進行電泳分離、目的片段回收和連接反應，然后用熱激法轉化E.coliDH5α。再經菌落PCR檢測和質粒酶切鑒定(BglⅡ和BstEⅡ)獲得重組表達載體。將其用凍融法轉化農桿菌GV3101并用AmRD22引物進行菌落PCR檢測，所得陽性克隆用于配制轉化菌液。

用常規方法將野生型擬南芥培養至花蕾初現，采用農桿菌蘸花法對其進行轉化，按照張文君等[27]方法進行轉化幼苗的篩選與PCR和半定量RT-PCR檢測，獲得AmRD22表達量較高的轉基因株系。

1.2.5 轉基因擬南芥耐逆性鑒定用T3代純合體進行耐逆性鑒定：(1)耐旱性鑒定。將種子在附加300或350 mmol/L甘露醇的1/2 MS固體培養基上培養，將2～3周齡的盆栽苗停止澆水15～18 d，再恢復正常澆水；(2)耐鹽性鑒定。將種子在附加150或175 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養基上培養，將盆栽10～15 d的幼苗澆200或300 mmol/L的NaCl溶液一次，4 d后恢復正常澆水；(3)耐冷耐凍性鑒定。將種子點種于1/2 MS培養基上于4 ℃放置3 d，然后放入6～8 ℃低溫光照培養箱中培養，將2～3周齡盆栽苗依次進行4 ℃/24 h、-6 ℃/6～8 h和4 ℃/24 h處理，之后恢復正常培養；(4)ABA敏感性鑒定。將種子在附加0.75或1.00 μmol/L ABA的1/2 MS固體培養基上培養；(5)Na+含量測定。用250 mmol/L的NaCl溶液澆3周齡盆栽苗一次，5 d后收集幼苗并用自來水和ddH2O漂洗干凈，置于80 ℃烘干至衡重，用原子吸收分光光度計(Zeenit Toop，Jenna，Germany)測定Na+含量。

上述實驗均以野生型擬南芥為對照，每次實驗每份材料至少用50粒種子或20株幼苗，實驗過程中觀測種子萌發和幼苗生長與存活等狀況。實驗重復3～5次。利用SPSS軟件包中的Duncan法進行轉基因株系與野生型之間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 AmRD22基因的克隆及其編碼蛋白分析

在前期得到了AmRD22的部分cDNA序列，其5′端不完整。本研究通過5′-RACE(圖 1，A)得到其5′端序列(761 bp)，與原序列拼接后獲得其全長cDNA序列(1 495 bp)，其中包含1 080 bp的完整編碼區。再通過PCR，從蒙古沙冬青低溫脅迫全長cDNA文庫[26]中擴增到該編碼區片段(圖 1，B)。推測其編碼蛋白含360 aa，相對分子質量為38.8 kD，等電點為8.4，初級結構由N末端21 aa的信號肽序列、34 aa的保守區、含3個TXV重復單元(TXVXVGKGGVNVXAX0～2KGKP，其中X為任意aa，0～2為其數目，后同)的可變區(92 aa)和C端213 aa的BURP結構域組成(圖 1，C)。信號肽中有16個疏水性aa，可變區重復單元中含T-V-VG-GGV保守序列，BURP結構域中含4個高度保守的半胱氨酸(C)-組氨酸(H)基序(排列方式：CHX10CHX25CHX25CH)和蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、色氨酸(T、P、V、W)等高保守殘基。此外，預測到AmRD22蛋白定位于細胞壁。

用AmRD22序列在GenBank中進行BlastP，發現與其序列相似性高的前3個蛋白依次為白羽扇豆(Lupinusalbus，78.0%)、狹葉羽扇豆(L.angustifolius，78.0%)和相思子(Abrusprecatorius，74.0%)的RD22或BURP蛋白，但目前尚未查到其研究報道。用AmRD22和其他植物中功能較明確的5個RD22蛋白構建進化樹，發現它與大豆GmRD22(ACM47360)和葡萄VvRD22(AAV36561)的關系較近，而與陸地棉GhRDL1(AAL67991)、擬南芥AtRD22(NP_197943)和咖啡CaBDP1的關系較遠(圖 2)。AmRD22與這些蛋白的序列相似性在45.4%～73.0%。

2.2 AmRD22基因的表達分析

室內培養下蒙古沙冬青幼苗中AmRD22在不同脅迫處理下的表達結果(圖 3，A、B)顯示：正常培養條件下(0 h，對照)該基因有明顯表達；干燥失水1～8 h后其表達量持續增加，24 h后明顯回落但仍顯著高于對照，4個時間點的平均表達量為對照的3.2倍；鹽脅迫1～8 h其表達量顯著高于對照，24 h后則顯著低于對照，平均表達量為對照的1.4倍；低溫處理期間其表達量呈現升-降-升的變化趨勢，但均顯著高于對照，平均為對照的3.7倍；ABA處理1～8 h其表達量也顯著高于對照，平均為對照的2.6倍，其中處理3 h表達量最高。這些結果說明4種脅迫處理均可誘導AmRD22的表達量顯著上調，但在時間進程和變化幅度上有所不同。

不同季節野外生長蒙古沙冬青成年植株葉片中AmRD22的表達變化模式(圖 3，C、D)表明，在7月上旬該基因只有少量表達，進入9月下旬其表達量明顯升高；從10月中旬至翌年1月中旬(中秋至隆冬)其表達量遠高于前2個月；在3月中旬和5月中旬其表達量又變得非常微弱。如以該基因在7月上旬(氣溫較適宜)的表達量作為對照，從10月中旬至翌年1月中旬其表達量平均上調了6.9倍。由此可見，AmRD22參與了蒙古沙冬青對秋、冬季寒冷天氣的響應。

2.3 AmRD22轉基因擬南芥耐逆性鑒定

成功構建了植物表達載體p3301-35S-AmRD22并通過農桿菌介導法轉化擬南芥。對所得T1和T2代幼苗分別進行PPT篩選、PCR檢測和半定量RT-PCR分析(圖 4)，獲得了4個AmRD22表達量較高的擬南芥轉基因株系R1、R3、R5和R9，用其T3代純合體進行耐逆性鑒定。

2.3.1 耐旱性鑒定耐旱性鑒定首先在種子萌發期進行，結果見圖 5。在1/2 MS培養基(0 mmol/L甘露醇)上，4個轉基因株系與野生型(WT)的種子萌發和幼苗生長狀況無明顯差異，但在其中附加300或350 mmol/L甘露醇后，前者的萌發和生長狀況均好于后者。以附加300 mmol/L甘露醇培養基上培養7 d時為例，WT的萌發率和幼苗根長分別為58.8%和4.5 mm，而4個轉基因株系分別為63.4%～78.3%和5.8～6.8 mm，其中R3、R5和R9株系的萌發率或根長顯著大于WT。然而，進一步在苗期進行控水干旱和復水處理，未發現4個株系與WT在耐旱性上存在明顯差異。這些結果表明，AmRD22的組成型表達提高了轉基因擬南芥在種子萌發期的耐旱性。

2.3.2 耐鹽性鑒定轉基因株系種子萌發期耐鹽性的鑒定結果見圖 6。在不含NaCl的1/2 MS培養基上，轉基因株系與WT的種子萌發和幼苗生長狀況相近，而在附加150或175 mmol/L NaCl的培養基上前者明顯好于后者。培養7 d時統計，WT在這兩種培養基上的萌發率分別為51.5%和21.7%，而4個轉基因株系分別為76.8%～90.9%和55.4%～65.9%，均顯著高于WT；WT的根長分別為4.2 mm和2.1 mm，而4個株系的根長分別為6.0～7.8 mm和4.0～4.4 mm，其中R3、R5和R9株系顯著長于WT。

苗期耐鹽性的鑒定結果見圖 7。未澆鹽水前，4個株系與WT之間無明顯差異。當澆以200 mmol/L的NaCl溶液后，WT幼苗的生長受到明顯抑制且有少數蓮座葉變得枯黃，而轉基因幼苗受抑制的程度明顯較輕且葉色基本正常(圖 7，A)；澆鹽水20 d后測量株高，WT為12.6 mm，而4個轉基因株系為29.4～36.0 mm，均顯著高于WT(圖 7，B)。若澆以300 mmol/L的NaCl溶液，WT會受到明顯傷害且大部分幼苗逐漸枯死，而轉基因幼苗受傷害的程度較輕，有部分幼苗能夠存活下來(圖 7，C)；澆鹽水15 d后統計存活率，WT為33.1%，而4個轉基因株系為60.9%～72.5%，均顯著高于WT(圖 7，D)。

上述結果表明，AmRD22的組成型表達顯著提高了轉基因擬南芥在種子萌發期和苗期的耐鹽性。4個株系相比，以R3和R9株系的耐鹽性較高(圖 6；圖 7，A-D)，為此測定了二者的Na+含量。從圖 7，E可見，澆250 mmol/L的NaCl溶液5 d后，R3和R9株系的Na+含量均低于WT，表明AmRD22的組成型表達減少了轉基因擬南芥中Na+的積累。

2.3.3 ABA敏感性鑒定眾所周知，ABA對種子萌發和幼苗生長有抑制作用[28]，上述表達分析也顯示外源ABA可誘導AmRD22表達量上調，為此觀測了轉基因種子在ABA脅迫下的萌發狀況。結果顯示，在附加0.75或1.00 μmol/L ABA的培養基上，轉基因種子在培養早期的萌發速度和胚根生長快于WT，但在培養一周左右這種差異基本消失。圖 8為培養4 d時的觀測結果，其中R3和R9株系與WT的萌發率和/或幼苗根長有顯著差異。這表明AmRD22可降低轉基因擬南芥在種子萌發早期對外源ABA抑制的敏感性。

此外，對轉基因株系在種子萌發期和苗期的耐冷耐凍表型進行了觀察，結果未發現有明顯變化。

上述結果表明，AmRD22主要在耐鹽性中發揮功能，在耐旱性和ABA敏感性中也起一定作用，但對低溫耐性無明顯影響。

3 討 論

RD22s是植物中普遍存在的一類逆境相關基因，其編碼蛋白多數由N端信號肽、短保守區、可變區和BURP結構域4部分組成[2]，也有少數RD22，如OsBURP05和ZmBURP04的編碼蛋白無信號肽或BURP結構域不完整[29-30]。N端信號肽的存在意味著其屬于分泌性蛋白，可能定位于細胞壁或質外體并在此發揮功能，此推測已在GmRD22、GhRDL1和AtRD22得到驗證[9-10]。可變區是不同RD22蛋白間差異最明顯的部分，主要由所含TXV重復單元數不同導致。多數RD22蛋白可變區內含3～5個TXV重復，每個重復單元中常含有T-V-VG-GGV保守序列，可能對維持RD22蛋白的結構和功能起重要作用[2,5]。BURP結構域是RD22亞族最保守的區域，常含有4個排列較穩定的CH基序和T、P、W等高保守殘基[6-8,24]，對決定其亞細胞定位和行使功能非常重要[9-10,17]。本研究發現AmRD22基因的編碼蛋白含有RD22亞族的上述4部分區域，并且其可變區內的T-V-VG-GGV保守序列和BURP結構域中的CH基序及T、P等高保守氨基酸齊全，故屬于典型的RD22亞家族成員，具備行使功能的基本結構基礎。在分子進化上，AmRD22與生理功能較明確的GmRD22和VvRD22關系較近，而與GhRDL1、AtRD22和CaBDP1關系較遠。這些信息為研究AmRD22的功能提供了重要參考依據。

前人發現RD22類基因的主要功能是參與對干旱/失水和鹽脅迫的響應并影響植物的耐鹽性和耐旱性，其中GmRD22、Tard22、Trrd22和VvRD22對耐鹽性和/或耐旱性起正調節作用[9,19-21]，而CaBDP1和AtRD22的作用與之相反[12,15]。蒙古沙冬青具有很強的綜合耐逆性，尤其以超常的耐寒性而著稱[25]，挖掘其耐寒基因是我們主要的研究興趣和目標所在。本研究發現AmRD22在失水、高鹽和低溫脅迫、尤其是秋季和冬季寒冷天氣下表達量明顯增加，推測其可能在抵御這些逆境、尤其是低溫逆境中起重要作用。然而，將該基因轉入擬南芥中表達顯著提高了其耐鹽性，其次是耐旱性，而對其耐冷性和耐凍性無明顯影響。這可能與異源表達和擬南芥本身具有較強的耐低溫特性有關，也可能是該基因自身的耐冷、耐凍功能本就微弱使然。由于蒙古沙冬青遺傳轉化體系尚未建立，我們已構建AmRD22轉基因楊樹和水稻并開展相關工作，以期進一步驗證其耐逆功能和利用價值。

有關RD22s的耐逆作用機制目前所知甚少，僅有Wang等[9]報道與木質素有關。木質素是植物細胞壁的重要組分[31]，尤其在根內皮層細胞壁上的凱氏帶中大量沉積[32-33]。它不僅能增強細胞壁的機械強度和保護作用，而且可阻止離子和水分通過質外體途徑進出植物體，在適應或抵抗高鹽和干旱等逆境脅迫中起重要作用[31-33]。Wang等[9]發現，GmRD22定位于質外體并可與催化木質素聚合的細胞壁過氧化物酶GmPer1互作，將GmRD22在擬南芥和水稻中表達可提高二者對高鹽和滲透脅迫的耐受性及木質素含量，同時GmPer1在擬南芥和水稻中的同源基因受鹽脅迫誘導表達量明顯上調。據此他們認為GmRD22可能與轉基因植株中的Per1類蛋白互作并激活其酶活性，從而促進了木質素的合成，增強了轉基因細胞在脅迫條件下的完整性和植株的耐逆性。我們發現AmRD22與GmRD22高度同源且定位于細胞壁，AmRD22的組成型表達降低了鹽脅迫下轉基因株系的Na+含量，推測AmRD22可能以類似于GmRD22的機制發揮其耐鹽耐旱作用。植物細胞壁是由多種成分組成的復雜動態結構，AmRD22也可能以其他方式作用于細胞壁或質外體而發揮其耐逆保護功能。要弄清其作用機理還需開展大量深入細致的工作。

ABA是重要的激素類信號分子，具有調控逆境脅迫響應基因表達和抑制種子萌發及幼苗生長等重要功能[28]。目前所知有許多RD22基因的表達受ABA調控，可能通過依賴于ABA的信號途徑發揮功能，其中AtRD22、Gm06.2/GmRD22和CaBDP1的研究較為清楚。AtRD22的啟動子區含ABA應答相關元件，其表達受失水、鹽脅迫和外源ABA誘導且需要ABA信號通路轉錄激活因子AtMYC2/rd22BP1和AtMYB2的合成與介導[3,13-14]。Gm06.2/GmRD22和CaBDP1的表達也受外源ABA誘導，其中前者的啟動子區含有ABA應答元件ABRE，后者轉入擬南芥可增強種子萌發期對外源ABA的敏感性[6,12]。本研究發現AmRD22的表達受不同非生物脅迫和外源ABA誘導，將其在擬南芥中表達增強了轉基因株系的耐鹽性和耐旱性，同時降低了其在種子萌發早期對外源ABA的敏感性，推測該基因通過依賴于ABA的信號途徑發揮功能。