玉米MCM2基因的克隆與功能驗證

李歡歡，武文昊，田文靜，郭東偉

(西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊陵 712100)

植物的生長發(fā)育受嚴格的細胞周期調(diào)控。為了滿足特定組織或細胞類型的生長發(fā)育和代謝要求，細胞的有絲分裂方式往往會發(fā)生一些改變，如核內(nèi)有絲分裂、內(nèi)復(fù)制。核內(nèi)有絲分裂是指有絲分裂過程中核膜不消失，有絲分裂發(fā)生在細胞核內(nèi)部，最終產(chǎn)生巨大的染色體如血液中的巨噬細胞。內(nèi)復(fù)制也叫內(nèi)多倍化，是指細胞只進行DNA復(fù)制，卻不發(fā)生分裂的一類特殊的細胞周期形式，由S期和G期組成，沒有染色體的濃縮和紡錘絲的形成，經(jīng)過幾輪復(fù)制后，會產(chǎn)生多倍化的細胞核，且相同組織的相鄰細胞之間由于內(nèi)復(fù)制發(fā)生程度的不同而呈現(xiàn)不同的倍性[1-2]。內(nèi)復(fù)制普遍存在于植物中，據(jù)統(tǒng)計超過90%的被子植物特定的器官中都存在不同程度的內(nèi)復(fù)制現(xiàn)象，尤其在禾谷類作物種子的胚乳、十字花科植物的塊根、百合科植物的鱗莖、葫蘆科植物的胎座組織等一些快速生長的組織中，往往存在大量的內(nèi)復(fù)制細胞[3]。目前，大量的研究認為，內(nèi)復(fù)制與植物的許多生命活動息息相關(guān)[4]，如胚軸伸長、毛狀體生長等[5-7]。在禾谷類植物種子的胚乳中，細胞在授粉后第6-8天開始進行內(nèi)復(fù)制，第18-20天達到高峰，30天以后隨著細胞凋亡的發(fā)生，淀粉的積累，內(nèi)復(fù)制也逐漸停止，其過程與籽粒的灌漿和快速膨大期完全一致，因此，內(nèi)復(fù)制也被認為是籽粒發(fā)育的關(guān)鍵性動力；此外，也有研究證實植物可以通過提高內(nèi)復(fù)制程度來抵御環(huán)境脅迫[8-10]。由此可見，細胞周期的調(diào)控對植物生長發(fā)育至關(guān)重要。

由于內(nèi)復(fù)制是一種缺少了分裂期的特殊有絲分裂，因此，大多數(shù)研究認為，有絲分裂和內(nèi)復(fù)制共用了相同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中CDK(細胞周期蛋白依賴性激酶)的活性是調(diào)控內(nèi)復(fù)制發(fā)生的關(guān)鍵，CDK活性高，細胞維持有絲分裂，活性下降細胞則由有絲分裂轉(zhuǎn)向內(nèi)復(fù)制，而且這一調(diào)控機制相當保守[11]。此外，內(nèi)復(fù)制的啟動也與pre-RC(復(fù)制前復(fù)合物)的精確組裝密切相關(guān)，pre-RC被認為是DNA進行復(fù)制許可和DNA解旋的關(guān)鍵；而pre-RC的精確組裝又受到MCM(微染色體維持蛋白)的影響。已有研究證明MCM2-7與G1期的DNA復(fù)制起源特異性相關(guān)[12]，在G1期，MCM2-7(微染色體維持蛋白)與Cdc6和Cdt1穩(wěn)定結(jié)合形成pre-RC，然后CDK和DDK(dbv4依賴激酶)激活MCM蛋白及其解旋酶活性，促使pre-RC啟動DNA復(fù)制[13]。在植物中，擬南芥的MCM7參與了早期胚胎發(fā)育和種子發(fā)育期間的胞質(zhì)分裂過程[14-16]；玉米的MCM3和MCM6在增殖組織中高度表達[17-18]。報道還發(fā)現(xiàn)，細胞中MCM水平的降低可能會打破基因組穩(wěn)定[19-20]。因此，MCM基因也是調(diào)控植物內(nèi)復(fù)制發(fā)生的關(guān)鍵因子。

本課題組前期用關(guān)聯(lián)分析方法，從119個不同內(nèi)復(fù)制水平的自交系中關(guān)聯(lián)到4個內(nèi)復(fù)制相關(guān)基因，其中一個為MCM基因。為了深入了解其在內(nèi)復(fù)制調(diào)控中的作用機理，本研究通過數(shù)據(jù)庫對MCM家族進行檢索、比對及篩選，分析了玉米MCM基因的基本生物信息特征，又對非生物脅迫條件下的表達特征進行了系統(tǒng)分析，并通過轉(zhuǎn)基因和酵母雙雜方法對其中ZmMCM2的功能和分子互作情況進行了初步探索，以期能夠為進一步深入理解MCM基因在內(nèi)復(fù)制調(diào)控過程中的作用機理提供實驗證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理

玉米(ZeamaysL.)自交系B73由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院玉米生物學與遺傳改良重點實驗室提供。選取飽滿且未受損的B73種子置于小燒杯中，加入鉀肥溶液，浸泡72 h，使其充分吸漲。然后將種子鋪于濕潤的棉紗，置于28 ℃條件下培養(yǎng)。將萌發(fā)的種子播于營養(yǎng)土，待幼苗長至三葉一心時，挑選長勢一致的玉米苗，將其根部洗凈進行處理。

處理條件分別為：100 μmol/L ABA、20% PEG6000、200 mmol/L NaCl、42 ℃、4 ℃[21]。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在12、24、48和72 h分別取20% PEG600、200 mmol/L NaCl、42 ℃、4 ℃處理條件下的玉米葉片；在2、6、12和24 h時取100 μmol/L ABA條件下的玉米葉片；0 h取樣為對照。將收集到的玉米葉片用錫紙獨立包裹，置于液氮桶中速凍，然后放于-80 ℃超低溫冰箱保存，以備qRT-PCR使用。

1.2 方 法

1.2.1MCM家族基因生物信息學分析在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)查找并下載MCM蛋白結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件，利用HMMER網(wǎng)站的玉米基因組初步鑒定基因家族，然后去除重復(fù)和冗余[22]。通過CDD數(shù)據(jù)庫以及SMART檢索并查閱含有MCM結(jié)構(gòu)域的基因序列[23-24]，使用Tbtools將含有MCM結(jié)構(gòu)域的序列名對應(yīng)的基因序列提取出來。使用網(wǎng)站(http:/linux1.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測每個MCM蛋白的亞細胞定位，在Gramene(http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫查詢基因的理化性質(zhì)。運用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)進行染色體定位分析，然后利用MCScan進行基因復(fù)制的分析。使用MEGA7.0中的鄰接法(neighbor- joining, NJ)繪制進化樹，設(shè)置Bootstrap為1 000次。選取MCM家族基因的前1 500 bp，并將其上傳到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站進行順式作用元件的分析，然后使用GSDD2.0網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)繪圖。

1.2.2 不同脅迫處理下MCM家族基因的特異性表達利用諾唯贊的植物總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。通過qRT-PCR分析MCM家族基因的表達情況，設(shè)置3個生物學重復(fù)，最后將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成熱圖形式。qRT-PCR體系如下：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正反引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye20.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。運用2-ΔΔCt的方法計算相對表達量[25]。

1.2.3ZmMCM2基因的克隆及轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的產(chǎn)生和表型分析用F(GATAAGCTTGAT-ATCGAATTCATGGATGACTCGGAGAACAA)和R(AGAACTA-GTGGATCCCCCGGGTTACT-CCGCCAGTGGAT-GCC)引物擴增基因ZmMCM2。以300 ng單鏈cDNA為模板，依次加入5×PrimeSTAR GXL 緩沖液10 μL，dNTPMIX 4 μL，PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶1 μL，混合體系共50 μL。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.30 min，30次循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。回收擴增產(chǎn)物，再凝膠純化，然后將目的片段插入OE6HA載體中。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)進農(nóng)桿菌GV3101，并用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。在含PPT的平板上選擇轉(zhuǎn)基因植株，然后轉(zhuǎn)移到土壤中。經(jīng)過3代鑒定和篩選，最終得到4個純合株系。后續(xù)實驗采用T3代純合株系進行表型分析。

將4個過表達及野生型擬南芥種子放于無菌水，置于4 ℃春化3 d；然后在春化好的種子中加入75%乙醇1 mL，搖8 min；用95%乙醇沖洗3次；在洗好的種子中加入0.3 mL無水乙醇，用槍吸打在已滅菌的濾紙上；待種子晾干，將種子均勻地撒于MS培養(yǎng)基，置于4 ℃放2 d；然后放在人工氣候箱中正常培養(yǎng)。待長出4片真葉，移植到營養(yǎng)土中正常培養(yǎng)。之后，對4個過表達擬南芥陽性植株(35S:ZmMCM2)和野生型(WT)在植株發(fā)育、種子大小、花期、蓮座葉數(shù)方面進行對比研究。

1.2.4 植物流式細胞術(shù)分析將野生型和過表達ZmMCM2的擬南芥植株葉片用刀片切碎，分別置于細胞核裂解液中：10 mmol/L MgSO4·7H2O，50 mmol/L KCl，5 mmol/L HEPES，3 mmol/L DTT，0.2%TritonX-100。然后利用50 μm孔徑的過濾器進行過濾，用(2 μg/mL)DAPI在冰上染色30 min。以C-value作為評價內(nèi)復(fù)制程度的指標，C-value的計算方法為[26]

式中，C-value代表細胞經(jīng)歷的循環(huán)值；n2C～n32C依次代表細胞核中2C～32C倍性細胞核粒子的數(shù)目，一個單倍體細胞核的DNA含量定義為1C。

1.2.5 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化玉米種子次氯酸鈉消毒后，無菌水浸泡過夜，種于土壤中，25 ℃暗培養(yǎng)，5～10 d可用于提取原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的提取方法參考文獻[27]，略有改動。選取中部葉片分離原生質(zhì)體，切成大約0.5 mm寬的條塊，20～30個條塊放在一起切碎，將其轉(zhuǎn)移到酶解液(1.5% 纖維素酶，0.3% 果膠酶，0.6 mol/L甘露醇，10 mmol/L MES，混合液調(diào)節(jié)pH至5.7，再加入1 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，混勻)中，避光，真空泵-15～-20(inHg)抽30 min；再避光酶解5～6 h，同時緩慢搖動(圓周搖床，速度40 r/min)；酶解結(jié)束后，加入與酶解液等體積的W5混合液(154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，4 mmol/L MES，調(diào)節(jié)混合液pH至5.7)，稍有力地用手水平搖動10 s，釋放原生質(zhì)體；然后使用40 μm尼龍膜將原生質(zhì)體過濾到50 mL的圓底離心管中，100 g水平離心3 min，待原生質(zhì)體沉淀，吸出上清；在沉淀中加入15 mL W5溶液，使原生質(zhì)體重懸，并冰浴30 min，使原生質(zhì)體自然沉降，盡可能棄上清；隨后，加入適量MMG混合液(0.4 mol/L甘露醇，15 mmol/L CaCl2，4 mol/L MES,調(diào)節(jié)混合液pH至5.7)重懸沉淀，調(diào)原生質(zhì)體密度至2×106個/mL，運用血球計數(shù)器計數(shù)；最后，吸取20 μg質(zhì)粒與200 μL原生質(zhì)體撥打混勻，并加入220 μL新配的PEG混合液(40% PEG4000，0.2 mol/L甘露醇，0.1 mol/L CaCl2)，混勻，在室溫下避光放置15～20 min，進行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化；誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化結(jié)束后緩慢加入880 μL W5混合液，輕輕顛倒混勻，100 g水平離心3 min，棄上清；再加入1 mL W5混合液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到六孔板中(已預(yù)先加入1 mL W5混合液)22 ℃暗處培養(yǎng)12～18 h，用于激光共聚焦顯微鏡下觀察鑒定。

1.2.6 酵母雙雜通過同源重組的方法將目的序列與pGBKT7載體連接，運用醋酸鋰(PEG/LiAc)方法將pGBKT7-ZmMCM2/pGADT7、pGBKT7-lam/pGADT7-T、pGBKT7-53/pGADT7-T共轉(zhuǎn)到Y(jié)2H酵母菌株中，并將酵母共轉(zhuǎn)液置于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade平板進行自激活驗證[28]。將pGBKT7-ZmMCM2轉(zhuǎn)入Y2H酵母菌株，置于SD/-Trp，并挑取大且圓潤的陽性單克隆用于后續(xù)實驗。

運用Mating篩庫法篩選互作蛋白，流程如下：將pGBKT7-ZmMCM2菌液置于30 ℃恒溫搖床，進行小搖活化，隨后進行大搖；其間吸出3 mL測OD600值，最終達到的范圍是0.8

測序結(jié)果進行序列比對，經(jīng)查閱文獻確定與研究內(nèi)容相關(guān)的基因，對其進行回轉(zhuǎn)驗證。回轉(zhuǎn)驗證流程如下：將陽性克隆接種到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d，待菌液渾濁，提取酵母細胞中的文庫質(zhì)粒。將提取到的文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10，然后涂布于LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，進行擴大培養(yǎng)。提取大腸桿菌中的文庫質(zhì)粒。根據(jù)篩選基因在文庫質(zhì)粒中的插入位置，設(shè)計特異性引物來擴增文庫片段，并對其進行回收、純化。將文庫片段和pGADT7重組。然后將陽性重組質(zhì)粒和pGBKT7-ZmMCM2共轉(zhuǎn)化Y2H酵母感受態(tài)，涂布于二缺、三缺以及四缺平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)，待菌斑長出，每個菌斑滴上2 μL X-α-Gal，觀察是否有菌落生長和變藍，進而判定互作效應(yīng)的真實性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmMCM家族基因分析

通過篩選和鑒定，得到17條ZmMCM基因，將其分別命名為ZmMCM1～ZmMCM17(表1)。本研究發(fā)現(xiàn)開放閱讀框大小為444(ZmMCM15)～2 874(ZmMCM2) bp，MCM基因含外顯子為1(ZmMCM12)～19(ZmMCM6)個，17條基因預(yù)測定位均為細胞核。值得注意的是ZmMCM3和ZmMCM4，ZmMCM8、ZmMCM9、ZmMCM14、ZmMCM15和ZmMCM17，ZmMCM7和ZmMCM10，ZmMCM5和ZmMCM1，ZmMCM13和ZmMCM16，這13條基因在玉米中分布于不同的染色體，屬于10種不同的蛋白，而在擬南芥中對應(yīng)5種蛋白，表明了不同物種中MCM家族基因的擴張和進化是不同的，而且ZmMCM家族成員之間外顯子數(shù)量差異可能與其功能多樣性有關(guān)。

表1 玉米MCM家族基因鑒定Table 1 Identification of maize MCM family gene

2.2 ZmMCM基因染色體定位分析

圖1顯示，ZmMCM家族成員分布于6條染色體，其中3號、6號和8號染色體上分布的基因最多，都是4條基因，1號染色體分布的基因最少，只有1個基因。而且ZmMCM家族基因中存在2個串聯(lián)重復(fù)序列，分布在6號染色體上，還存在6條片段復(fù)制序列，除了1號染色體，其他染色體均分布有片段復(fù)制序列。因此，ZmMCM家族基因組的進化可能是由串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制引起的。

2.3 不同物種MCM蛋白系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用玉米(Zm)、水稻(Os)與擬南芥(At)的MCM蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果可分為6個亞家族(圖2)。玉米、水稻以及擬南芥MCM家族成員在6個亞家族中均有分布。水稻和擬南芥的同一種MCM蛋白與玉米的相應(yīng)MCM蛋白分布于不同的亞家族。只有ZmMCM2、OsMCM2和AtMCM2三個成員分布于第Ⅳ亞家族，且ZmMCM2和OsMCM2分支較晚，進化更為保守。分支越早的亞組之間具有較遠的親緣關(guān)系和進化關(guān)系，而同一組的MCM成員之間具有較高的同源性。結(jié)果表明大多數(shù)水稻和擬南芥MCM蛋白的遺傳進化關(guān)系更親近，而玉米MCM蛋白成員之間親緣關(guān)系更近，結(jié)構(gòu)更保守。

2.4 ZmMCM家族基因順式作用元件分析

為了解玉米MCM基因的表達調(diào)控機制，對其啟動子序列進行順式作用元件預(yù)測，共預(yù)測到331個順式作用元件(圖3)。除了ZmMCM1和ZmMCM8，其他基因都至少含有一種與激素響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件。除此之外，ZmMCM基因啟動子中還存在與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如響應(yīng)干旱的MBS和低溫的LTR。表明ZmMCM基因可能參與非生物脅迫響應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)部分基因啟動子含有參與胚乳表達的GCN4_motif、玉米蛋白代謝調(diào)節(jié)的O2-site、種子特異性調(diào)控的RY-element和葉片衰老調(diào)控的W box，表明ZmMCM可能參與調(diào)控玉米不同階段的生長發(fā)育。

2.5 不同脅迫處理下玉米MCM家族基因的表達

基于ZmMCM家族基因在激素以及脅迫方面的調(diào)控作用，為挖掘調(diào)控非生物脅迫的基因，選擇苗期玉米作為實驗對象，對其進行不同脅迫處理，以檢測它們的表達水平。結(jié)果(圖4)表明，ZmMCM家族基因在高鹽脅迫下整體被抑制表達；ZmMCM7在ABA處理24 h時輕微誘導(dǎo)，說明它可能對重度的ABA脅迫具有一定的調(diào)控作用；ZmMCM12、ZmMCM13、ZmMCM14、ZmMCM15、ZmMCM16、ZmMCM17等在干旱脅迫12 h時表達水平顯著提高，推測這些基因具有調(diào)節(jié)輕度干旱的能力；ZmMCM3在高溫脅迫24 h時誘導(dǎo)表達，ZmMCM2在48和72 h時表達量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，它們可能在一定程度上調(diào)節(jié)高溫脅迫；同時，ZmMCM4、ZmMCM5、ZmMCM13、ZmMCM14、ZmMCM17在低溫處理12、24、48和72 h時被顯著誘導(dǎo)，且高于對照；ZmMCM3、ZmMCM10在12和24 h時表達量顯著提高，這些基因能夠?qū)Φ蜏乜焖僮龀鲰憫?yīng)，表明它們可能在防御低溫脅迫方面發(fā)揮重要作用。綜上所述，MCM基因的表達受到ABA、NaCl脅迫的抑制，它們對脅迫幾乎無響應(yīng)，而面對干旱、高溫以及低溫的影響，在不同時間段表現(xiàn)出不同程度的應(yīng)答。

2.6 35S:ZmMCM2的過表達影響擬南芥生長發(fā)育

圖5，A顯示，同一時期的過表達擬南芥植株較野生型矮化。這可能是因為ZmMCM2基因過度表達會對擬南芥的內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生一定的抑制作用，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的尺寸發(fā)生變化。ZmMCM2基因在花發(fā)育過程中并不顯著，推測其在花發(fā)育過程中可能沒有明顯的調(diào)節(jié)作用(圖5，B)。轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉數(shù)明顯減少(圖5，C)，且種子體積減小(圖5，D、E)，這可能是內(nèi)復(fù)制程度的變化影響了細胞的分裂與分化導(dǎo)致的結(jié)果。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的突出表型說明，ZmMCM2基因的異源過表達影響了擬南芥植株的生長和發(fā)育。

2.7 35S:ZmMCM2的過表達抑制擬南芥葉片的內(nèi)復(fù)制程度

利用流式的方法對過表達擬南芥植株的內(nèi)復(fù)制程度進行分析，來進一步驗證諸多表型的產(chǎn)生與內(nèi)復(fù)制的關(guān)系。結(jié)果表明，與野生型相比，過表達植株2C、4C以及8C倍性細胞占比較大，且過表達擬南芥中沒有出現(xiàn)16C(圖6，A、B)；過表達植株的C值低于野生型(圖6，C)。總之，研究結(jié)果表明過表達擬南芥植株的倍性降低，內(nèi)復(fù)制程度被減弱。說明ZmMCM2基因負向調(diào)控了內(nèi)復(fù)制的發(fā)生。

2.8 玉米MCM2的亞細胞定位

細胞周期調(diào)控因子的功能需要對特定細胞區(qū)域進行定位，因此，通過研究ZmMCM2蛋白在細胞內(nèi)的定位情況，可為理解其作用機制提供研究方向。通過PEG介導(dǎo)法將ZmMCM2和GFP融合載體轉(zhuǎn)化到玉米原生質(zhì)體中進行表達，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ZmMCM2-GFP融合蛋白在細胞核內(nèi)出現(xiàn)強烈的綠色熒光，表示ZmMCM2蛋白主要在植物細胞核中表達(圖7)。

2.9 ZmMCM2互作蛋白篩選

為更好地了解ZmMCM2蛋白的分子調(diào)節(jié)機制，運用酵母雙雜交篩選與其相互作用的潛在蛋白質(zhì)。首先通過自激活驗證可知(圖8，A)，陽性對照、陰性對照以及目的基因均在二缺板正常生長，四缺板上僅有陽性對照生長，因此，可判定ZmMCM2無自激活能力；然后運用Mating法篩選與ZmMCM2互作的蛋白，一共篩選出22個陽性克隆；最后，選擇了一個與細胞周期相關(guān)的細胞分裂蛋白CDC73進行回轉(zhuǎn)驗證，結(jié)果表明ZmMCM2與CDC73之間存在互作關(guān)系(圖8，B)。

3 討 論

內(nèi)復(fù)制是一種特殊的細胞周期[29]，對動植物的細胞生長起著至關(guān)重要的作用。細胞周期準確、規(guī)律地運轉(zhuǎn)需要pre-RC的控制，而MCM2-7作為復(fù)制前復(fù)合體的組成部分，對pre-RC調(diào)控功能的實現(xiàn)至關(guān)重要[13]。因此，研究MCM遺傳進化以及功能對于豐富內(nèi)復(fù)制調(diào)控的分子機理具有重要意義。

本研究在玉米中共鑒定到17個ZmMCM家族基因，比擬南芥以及水稻多，這可能與玉米及其祖先在進化過程中基因組的擴張有關(guān)。而且染色體定位分析中存在串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制序列，這可能是導(dǎo)致ZmMCM家族基因數(shù)目增加的主要原因。ZmMCM基因啟動子序列中含有許多與植物激素、以及脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。前人研究豌豆中MCM6基因的鹽脅迫抗性表明，MCM6轉(zhuǎn)錄物在高鹽和冷脅迫下上調(diào)，而在ABA、干旱和熱脅迫下不上調(diào)[30]。而本研究通過對玉米中MCM家族基因的非生物脅迫研究表明，ZmMCM基因表達在NaCl和ABA脅迫下被明顯抑制，在PEG、高溫以及低溫處理下基因不同程度響應(yīng)脅迫，尤其是對低溫具有明顯應(yīng)答，玉米中MCM6表達也是如此。這說明不同物種中的MCM基因在應(yīng)對非生物脅迫方面有所差異。

擬南芥MCM2和MCM7基因以及玉米MCM3和MCM6基因在部分增殖組織中表達較高，有助于促進細胞分裂，滿足分生組織的生長需要[15,17-18]。Ni等[31]的研究顯示，ATMCM2過表達對細胞內(nèi)復(fù)制有抑制作用，但對細胞增殖沒有影響。以上研究表明MCM家族基因可能在有絲分裂調(diào)控中發(fā)揮作用。然而，MCM2作為DNA復(fù)制的正調(diào)控因子，按理說MCM2基因過表達會增加內(nèi)復(fù)制程度，Harada為這種悖論提出了解釋，他認為MCM2過表達可能影響pre-RC亞基間的化學計量數(shù)，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制受到損傷，最終參與DNA復(fù)制負調(diào)控。因此，MCM2可能是DNA合成起始的速率限制因素[32]。從水稻中分離出的MCM2蛋白與酵母MCM2突變體互補，說明MCM2蛋白在功能上具有相似性[33]。目前，玉米中MCM2蛋白的作用機理尚不清楚。因此，本研究從玉米中分離出MCM2基因，并將其轉(zhuǎn)化進擬南芥，探究其過表達對擬南芥生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明MCM2基因的過表達延長了G2期，從而延遲內(nèi)循環(huán)發(fā)生，導(dǎo)致植株表型發(fā)生改變。研究結(jié)果與擬南芥和水稻MCM2的結(jié)果一致[31]，表明MCM2蛋白在物種間具有一定的保守性。

MCM2蛋白含有核定位序列(NLS)。目前只有裂殖酵母、芽殖酵母和小鼠中證實了MCM2的核定位特性。植物MCM2蛋白定位研究較少，本研究對ZmMCM2進行定位的結(jié)果表明， ZmMCM2蛋白表達于細胞核，與前人研究結(jié)果一致[34]，可能是因為MCM2蛋白的主要功能是將具有酶活性的MCM6和其他MCM蛋白帶入細胞核，這與其要行使的功能相一致。此外，本研究還通過酵母雙雜交技術(shù)，利用cDNA文庫篩選出一個與ZmMCM2相互作用的細胞周期分裂蛋白CDC73，為下一步更深入的分子互作機理奠定了基礎(chǔ)，相關(guān)研究尚未見報道。