5種外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長的緩解效應

劉 鑫，付麗娟，于 靜，鄭鈉元，劉保東，丁國華*

(1 哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院, 哈爾濱 150025; 2 中國人民大學 附屬中學豐臺學校, 北京 100074)

隨著全球氣候變化的加劇，極端氣象事件的頻繁發生和降雨格局的變化加劇了區域尺度的干旱程度，導致世界范圍內大面積森林死亡，這對全球造成了嚴重的影響[1-2]。干旱對植物的傷害主要表現為光合下降、生長減慢、膜透性增加、細胞內容物外滲和失水萎蔫，產生這些傷害的主要原因是活性氧的增加所造成的氧化傷害。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等是細胞抵御活性氧傷害的酶保護系統，逆境脅迫下的植物主要通過提高抗氧化酶活性清除體內多余的活性氧，降低膜脂過氧化作用，增強植物對逆境脅迫的抵抗能力。

桫欏科(Cyatheaceae)植物起源于南美洲或澳大利亞的晚侏羅紀，是現存唯一的樹狀蕨類植物，其中筆筒樹(Sphaeropterislepifera)分布于中國廣東及福建的山坳中[10]。筆筒樹在生長發育過程中對環境要求苛刻，喜陰濕，忌強光。近年來，蕨類植物以其別具一格的觀賞性越來越受到人們的喜愛，但目前野生蕨類植物資源已受到嚴重破壞，引種馴化已成為一種既能滿足人們的觀賞需求又能進一步保護種質資源的途徑。干旱是引種馴化工作中需要解決的常見問題。如何提高筆筒樹的抗旱性成為影響其能否在含水量較低地區進一步推廣的重要因素。為此，提升筆筒樹抗旱性和外界環境適應性已成為當前研究重點內容。目前，應用外源物質提高蕨類抗旱性的研究鮮見報道。本研究以筆筒樹為材料，測定外源SA、MT、PP333、Ca和EBR對干旱脅迫下筆筒樹幼苗的生長和生理特性的影響，為探究外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗的緩解效應和生理機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

筆筒樹[Sphaeropterislepifera(Hook.) R. M. Tryon]孢子于2020年采自華南植物園，在4 ℃下保存；培養所用土壤取自黑龍江省尚志市帽兒山，土壤類型為暗棕壤；水楊酸購自哈爾濱化工化學試劑廠；氯化鈣購自黑龍江省阿城化學試劑廠；褪黑素、多效唑和2，4-表油菜素內酯均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗設計

參照檀龍顏等[11]的方法，將參試土壤過10目篩網后置于蒸汽高壓滅菌鍋中滅菌以除去蕨類及苔蘚孢子，滅菌條件為131 ℃、40 min，得到實驗用土。將所有實驗用土充分混勻，在電熱溫箱中烘干至恒重。取28個方形帶蓋1 L的培養盒，每盒加入300 g上述干土和160 mL蒸餾水(含水量約為35%)。按劉保東等[12]方法播種筆筒樹孢子。播種后每4 d噴施1次蒸餾水，保證土壤含水量在33%～37%，當筆筒樹生長至孢子體時期，將28盒材料平均分為7組，分別進行如下處理。CK為非干旱對照組，繼續每4 d噴施1次蒸餾水，使土壤含水量保持在 33%～37%；DCK為自然干旱對照組，不進行噴施處理；DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR為外源物質處理組，是在自然干旱的同時分別噴施1.0 mmol/L SA、150 μmol/L MT、100 mg/L PP333、2.5 mmol/L CaCl2和0.3 mg/L EBR溶液，外源物質最適濃度通過預實驗的結果獲得。

噴施處理時將不同溶液裝入壓力噴壺，在幼苗上方5 cm處勻速噴霧，葉片表面均勻附著一層溶液即可。處理時間與CK組相同，即每4 d噴施1次，共噴施4次，每個處理3次重復，每個重復8～10株幼苗。每次噴施處理后的次日上午取樣，設第1次噴施處理為第0天，則4次取樣的時間分別為第1、5、9和13天；在每處理組中隨機選取6株幼苗，測定生長量、光合特性指標和相對電導率；在其余的幼苗中剪取生長狀況基本一致的充分展開葉，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于其他指標的測定。取樣和測定生理指標時各處理均進行3次重復。

試驗期間每隔4 d取樣測定1次各處理土壤含水量(表1)，用公式(N-M)/N計算。式中：N表示烘干前土壤質量(g)，M表示電熱溫箱烘干后土壤質量(g)。由表1可知CK的土壤含水量保持在34%～37%，DCK、DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR的含水量均逐漸降低，處于干旱脅迫狀態。材料培養條件設置為：光照25 ℃/14 h，黑暗25 ℃/10 h，相對濕度為50%。

表1 試驗期間各處理土壤含水量Table 1 Soil moisture of each treatment during the test

1.3 測定指標及方法

用游標卡尺測定第1 天和第13 天植株地上部分和地下部分的長度，差值即為生長量，進一步得到生長率，生長率(%)=(第13天長度-第1 天長度)/第1 天長度×100%[13]；在第1、5、9和13天采集葉片樣品，用Li-6400便攜式光合作用測定儀測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)，用雙波長法測定新鮮葉片的葉綠素含量(Chl)，浸提液為95%乙醇[14]。

同時，第1、5、9和13天葉片樣品的可溶性糖(SS)含量測定采用蒽酮比色法[15]，脯氨酸(Pro)含量測定采用磺基水楊酸法[16]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[17]，相對電導率(EL)采用電導率儀測定[18]；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑法[18]，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚顯色法[16]，過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫法[19]。

1.4 試驗數據處理

采用Excel 2013軟件處理數據，采用SPSS Statistics 20軟件對數據進行顯著性檢驗和相關性分析。將整理后的數據，用模糊數學隸屬度公式進行定量轉換，再將各指標隸屬函數值取平均值進行相互比較。隸屬函數公式為：

U(Xi)=(Xi-Xmax)/(Xmax-Xmin)

式中U(Xi)為隸屬函數值，Xi為某項指標測定值，Xmax和Xmin為所有處理中某一指標的最大值和最小值[20]。

2 結果與分析

2.1 外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長的影響

在自然干旱脅迫第13天時，觀察各處理筆筒樹幼苗表型(圖1)可知，與CK處理相比，DCK處理幼苗有較多的葉片出現黃化，底層葉片邊緣枯萎；與DCK處理相比，DCK+SA處理幼苗的葉片明顯復綠，生長狀態與CK接近；DCK+MT、DCK+Ca和DCK+PP333處理幼苗的個別葉片出現黃化，但是黃化程度都輕于DCK處理。

同時，對各處理筆筒樹幼苗生長指標的測定結果(表2)顯示，干旱脅迫顯著抑制筆筒樹幼苗地上部分的生長，DCK處理幼苗地上部分的生長量比CK顯著降低了20.00%，其生長率較CK降低1.78%；各外源物質處理組幼苗地上部分的生長量均顯著高于DCK處理，其中的DCK+SA和DCK+EBR處理又顯著高于其余處理，其生長量恢復至CK水平，生長率明顯高于CK。同時，干旱脅迫顯著促進地下部分的生長，DCK處理幼苗地下部分的生長量比CK顯著增加了10.64%，其生長率較CK增加了0.87%；各外源物質處理幼苗生長量和生長率均不同程度地高于DCK處理，其中的DCK+SA和DCK+EBR處理均較高，生長量增幅均達到顯著水平，生長率分別較DCK提高2.26%和2.31%。可見，外源物質SA、MT、PP333、Ca和EBR對干旱脅迫下筆筒樹幼苗地上和地下部分的生長都有一定促進作用，并以SA和EBR處理的促進效果更佳。

表2 不同處理下筆筒樹幼苗生長的變化Table 2 Variation of the growth of S. lepifera seedlings under different treatments

2.2 外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗光合特性的影響

圖2顯示，在干旱脅迫(DCK)條件下，筆筒樹幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和葉綠素含量在各時期均比CK不同程度降低，且除第1天外降幅均達到顯著水平，各指標在第13天時分別下降到CK的55.12%、72.41%、66.01%和34.72%(P<0.05)。從第5天開始，各外源物質處理幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和葉綠素含量均不同程度地高于同期DCK處理，且干旱脅迫時間越長增幅越大，在干旱脅迫第9和13天增幅均達到顯著水平，并多以DCK+SA、DCK+MT和DCK+EBR處理的表現更突出。其中，在處理第13天時，與DCK處理相比，筆筒樹幼苗葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和葉綠素含量分別增加15.93%～39.82%、4.79%～25.40%、1.40%～24.25%和18.37%～34.93%。可見，各類外源物質均能有效緩解干旱脅迫對筆筒樹幼苗葉片光合作用的抑制，并以適宜濃度的SA和MT處理的緩解效果更好。

2.3 外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗細胞膜傷害的影響

各時期干旱脅迫(DCK)筆筒樹幼苗葉片的相對電導率和MDA含量均比同期CK不同程度增加，且除了第1天外差異均達到顯著水平(P<0.05)，在第13天時分別較CK顯著增加了64.12%和26.10%(圖3)。各外源物質處理(DCK+SA、DCK+MT、DCK+PP333、DCK+Ca和DCK+EBR)幼苗葉片的相對電導率和MDA含量均比同期DCK處理不同程度降低，相對電導率在第9天、MDA含量在第5天開始降幅均達到顯著水平；在干旱脅迫第13天時，各處理葉片相對電導率和MDA含量比DCK處理分別顯著下降13.17%～21.85%(圖3，Ⅰ)和11.99%～24.29%(圖3，Ⅱ)，并均以DCK+SA和DCK+EBR處理明顯較低，顯著低于其余處理。結果表明，外源物質處理能夠顯著降低干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片的相對電導率和MDA含量，并以SA和EBR處理對植物細胞膜傷害的緩解效果較好。

2.4 外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

從圖4可知，隨著干旱脅迫時間的延長，干旱脅迫和各外源物質處理筆筒樹幼苗的SOD和POD活性均呈現先上升后下降的趨勢，并均在第5天達到最大值，而它們的CAT活性均逐漸下降。在干旱脅迫第1天，DCK和各外源物質處理幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均與CK無顯著差異。在脅迫第5～13天，DCK處理幼苗葉片的SOD、POD和CAT活性在各時期大多比CK顯著降低；各外源物質處理SOD、POD和CAT活性在各時期大多比DCK處理不同程度升高，且脅迫時間越長差異越明顯，并以DCK+SA、DCK+MT處理的酶活性明顯較高；在脅迫第13天時，DCK處理葉片的SOD、POD和CAT活性分別為同期CK的74.94%、87.64%和84.16%，差異達到顯著水平(P<0.05)；各外源物質處理SOD、POD和CAT活性與DCK處理相比分別增加5.18%～18.79%、0.43%～9.33%、1.92%～7.84%，并均以DCK+SA和DCK+MT和DCK+EBR處理增幅較大，均達到顯著水平。由此可知，隨著干旱脅迫的加劇，筆筒樹幼苗葉片抗氧化酶活性下降，外源物質處理可以有效緩解抗氧化酶活性降低，增強其抗旱性，并以噴施SA、MT和EBR的增強效果較好。

2.5 外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗滲透調節作用影響

由圖5可知，在干旱脅迫(DCK)下，筆筒樹幼苗葉片脯氨酸和可溶性糖含量在干旱脅迫處理第5～13天均比CK顯著增加，在第13天時增幅分別達到100%和28.08%(P<0.05)；干旱脅迫條件下，各外施外源物質處理葉片的脯氨酸含量也均顯著高于同期CK，但與同期的DCK處理均無顯著性差異；與DCK處理相比較，各外源物質處理葉片的可溶性糖含量在第5天無顯著變化，在第9～13天大多顯著降低，且以DCK+SA和DCK+MT處理相對較低；在脅迫處理第13天時，各外源物質處理葉片可溶性糖含量分別較DCK處理顯著降低了12.39%、11.99%、5.48%、8.02%和11.76%(P<0.05)，而其脯氨酸含量降低幅度不顯著。以上結果表明，各外源物質均能顯著降低干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片可溶性糖含量，有效緩解其積累，并以EBR處理效果最好，但5種外源物質對脯氨酸積累都沒有顯著影響。

2.6 外源物質對筆筒樹幼苗干旱脅迫傷害緩解作用的綜合評價

根據單一指標評價外源物質對干旱脅迫下筆筒樹幼苗傷害的緩解效應，難以真實準確地反映緩解效果。本研究通過隸屬函數法將每個指標值轉換為(0, 1)的純數，優化了不同指標之間的可比性，對不同處理下的幼苗13個相關生理指標進行綜合分析，最后根據各處理平均隸屬度值的由大到小進行排序，位次越靠前，處理的緩解效果越好。結果(表3)表明，5種外源物質對筆筒樹干旱脅迫的緩解效果表現為：SA>MT>EBR>Ca>PP333，這與各處理幼苗葉片的表型觀察結果相似。

表3 各外源物質處理下指標的隸屬函數值Table 3 Membership function value of indicators under the treatment of various exogenous substances

3 討 論

干旱脅迫是對植物生長產生負面影響的主要威脅之一，可能導致ROS積累與抗氧化防御系統之間的失衡，造成氧化損傷。干旱脅迫還會抑制植物的生長發育，處于生殖生長階段的植物對干旱脅迫高度敏感。

本研究的結果表明，干旱脅迫顯著抑制筆筒樹地上部分生長，促進地下部分生長，證明當土壤水分條件發生變化時，筆筒樹幼苗會發生形態的變化來適應干旱環境。隨著干旱脅迫時間的延長，筆筒樹幼苗的地上部分生長量減少，地下部分生長量增加，可能是由于干旱脅迫抑制了植物的細胞分裂，生物量分配傾向于地下部分，導致植株地上部分矮小、生長緩慢[21]。植物生長通常具有“旱長根、水長苗”的特性，蕨類植物筆筒樹幼小的孢子體的生長也遵循這一規律。研究表明，EBR在調節植物細胞形態和生長發育進程中發揮重要作用。通過對一種BR合成缺陷突變體cpd(constitutive photomorphogenic dwarf)的研究中證明，BR 在植物生長中所起到的作用，揭示了 BRs 在有絲分裂調控中的作用[22]。本研究結果表明，干旱脅迫下噴施5種外源物質對筆筒樹幼苗的生長具有促進作用。也表明干旱脅迫下經SA、MT、CaCl2和EBR處理的植株株高和根長均較未處理對照顯著增加[23-26]。

同時，本研究中干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長量的下降可能是由于ROS的過量產生，導致膜穩定性降低和MDA含量升高[27]，加劇脂質、蛋白質和葉綠素的損傷，并最終減少植物生物量積累。本研究中外源施用SA、MT、PP333、CaCl2和EBR可以提高筆筒樹幼苗的抗旱性，這可能與提高了筆筒樹葉片光合作用效率和葉綠素含量、增強了葉片的氣體交換屬性、促進了抗氧化酶活性、降低了相對電導率和MDA含量有關。此前，有一些研究報道了干旱對許多植物生長都具有破壞性影響，破壞的范圍因脅迫的嚴重程度和植物生長階段而不同。也有研究表明SA、MT、PP333、CaCl2和EBR在干旱脅迫下對不同植物的生長性狀有重要的改善作用。

植物在遭受干旱脅迫時，為了減少水分損失和細胞內CO2濃度而減少氣孔開度，造成光合作用中的氣孔限制。同時，光合系統接收的過多光能由于無法正常耗散而造成細胞的受損，細胞中累積 ROS 轉而造成葉綠素的消解并攻擊光合作用機構，造成不可逆的傷害，從而導致光合作用效率總體下降。本研究發現，隨著土壤水分含量降低，筆筒樹幼苗葉片的Pn、Gs、Tr和葉綠素含量出現下降的趨勢，說明干旱脅迫下Pn和Gs的下降，嚴重影響水分利用和氣體交換。葉面噴施SA、MT、PP333、CaCl2和EBR均緩解了這些指標的下降趨勢。Habibi等[28]研究表明，干旱脅迫大麥植株葉片的Pn、Gs和Tr顯著降低，而噴施SA處理能顯著提高這些參數。其他研究結果也表明，適當施用MT、PP333、CaCl2和EBR能顯著抑制干旱條件下植物葉片Pn、Gs、Tr和葉綠素含量降低的幅度，對葉片光合作用有積極的緩解作用[24, 29-31]。

另外，植物還通過調節生理代謝抵御或緩解干旱脅迫造成的傷害，這些自發的調節體現著植物本身的耐旱性。脯氨酸和可溶性糖是干旱脅迫下植物滲透調節過程中非常重要的物質。本研究結果表明，干旱脅迫下筆筒樹幼苗葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量顯著增加，增強了自身適應逆境的能力，與王雨婷等[32]在葡萄上的研究結果一致。經過SA、MT、PP333、CaCl2和EBR處理的筆筒樹幼苗葉片的可溶性糖含量增加較緩，可能與這些物質在干旱前期減輕了植株受損強度等因素有關，與前人的研究結果一致[40-41]。而本研究中5種外源物質對筆筒樹幼苗葉片脯氨酸含量無顯著影響，可能是由于脯氨酸在蕨類植物的滲透調節過程中不起主要作用，或脯氨酸的合成和降解只與筆筒樹水分狀況有關。

4 結 論

干旱脅迫限制了筆筒樹幼苗的正常生長。外施SA、MT、PP333、Ca和EBR對干旱脅迫下幼苗生長的緩解作用是多個生理活動相互作用的結果，本研究對13個相關生理指標進行了相關性和隸屬函數分析，根據綜合得分位次得出，SA對干旱脅迫下筆筒樹幼苗生長的緩解效果最好，其后依次為MT、EBR、Ca和PP333。這些外源物質可以減緩筆筒樹幼苗光合系統遭受的破壞，維持幼苗正常生長；通過調節抗氧化酶活性，減輕膜脂過氧化損傷，降低MDA含量和相對電導率，保護細胞膜結構的穩定性，在一定程度上提高了筆筒樹的抗旱能力。

劉鑫是本研究的實驗設計者和實驗研究的執行人，完成數據分析，論文初稿的寫作；于靜，鄭鈉元協助實驗進行；付麗娟，劉保東參與實驗設計；丁國華是項目的構思者及負責人，指導實驗設計、數據分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。