麥冬和青綠薹草對土壤苯并[a]芘的去除率及葉片生理響應特征

張靈巧，朱夢婷，彭 穎，宋林姝，劉 燕*

(1北京林業大學 園林學院，北京 100083；2花卉種質創新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083；3國家花卉工程技術研究中心，北京 100083；4城鄉生態環境北京實驗室，北京 100083)

苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，BaP)在環境中分布廣泛，性質穩定，是國內外環境監測的重要指標之一[1]，也是美國環保局(EPA)公布的優先監測的16種多環芳烴中的一種，是致癌性最強的物質之一[2]。研究表明暴露在苯并[a]芘中會對動物造成各種傷害，引起機體的氧化應激作用，還會影響細胞周期，對DNA造成損傷，同時干擾動物的內分泌[3]。環境中的苯并[a]芘大多數存在于地表土壤中[4]，生物合成、自然起火和火山活動構成了苯并[a]芘的天然本底值，人類活動是造成苯并[a]芘污染的主要原因[5]。

國內外文獻均報道人居環境土壤中含有不同濃度的苯并[a]芘。波蘭克拉科夫(Cracow)各交通干線及鋼鐵廠周圍土壤中含有苯并[a]芘等多環芳烴，其濃度高達0.8 mg/kg[6]；日本大阪市區土壤中苯并[a]芘含量達1.190～4.930 mg/kg，高于郊區約100倍[7]；立陶宛的維爾紐斯市(Vilnius)大氣沉降物中每年都有苯并[a]芘的積累[8]。中國河北省的土壤苯并[a]芘含量最大值為0.298 mg/kg，其污染以鋼鐵工業發達的城市及其附近的區域為核心[9]；西安、廣州、深圳、廣州等8個城市污泥及土壤中的苯并[a]芘平均含量為1.69 mg/kg[10]；上海市部分土壤中苯并[a]芘含量高達0.73 mg/kg[11]；烏魯木齊污灌區農田土壤中苯并[a]芘平均含量為0.92 mg/kg[12]。北京市3個帶狀公園綠地土壤樣品中含量最高的多環芳烴是苯并[a]芘，濃度為0.6 mg/kg左右[13]；北京市區公園綠地和居住區綠地表層土壤樣品普遍受到多環芳烴的污染，其中苯并[a]芘的貢獻率在10%以上，平均濃度達0.58 mg/kg，且隨年份推移，污染程度呈增加趨勢[14]；根據建設用地土壤污染風險管控標準GB36600-2018[15]，北京地區園林綠地土壤中的苯并[a]芘濃度達到了第一類用地的土壤篩選值0.55 mg/kg，存在一定的風險。

植物可以從土壤中吸收苯并[a]芘等多種多環芳烴，但會對植物的生長造成傷害[16-18]。研究顯示，不同濃度的多環芳烴對植物的生長會造成不同的影響[4,19-22]，但目前主要集中在對菲、芘等多環芳烴的研究，而對于多環芳烴中致癌性最強且分布廣泛的苯并[a]芘研究尚不夠重視，對清除苯并[a]芘的植物選擇研究較少，僅見黑麥草、地毯草、白三葉、蘇丹草及部分羊茅屬草坪草植物的報道[23-26]，其去除機制主要有直接吸收、根部釋放分泌物和酶促進其分解、植物強化根際微生物的降解作用等[24,27]。因此，選擇更多可以清除土壤苯并[a]芘的植物種類用于環境綠化建設有重要意義。

麥冬(Ophiopogonjaponicus)和青綠薹草(Carexbreviculmis)是北京綠地中的常綠地被植物，有一定耐陰性，可在北京露地越冬[28-32]，本研究旨在考察這兩種園林植物對土壤不同濃度苯并[a]芘的耐受性、去除率及其在苯并[a]芘脅迫下葉片的生理變化，為今后選擇可清除土壤有機污染的園林植物提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料與試驗設計

供試植物麥冬(O.japonicus)和青綠薹草(C.breviculmis)為2年生的工程苗，購自北京綠普方圓花卉科技有限公司。試驗用盆栽土源自北京林業大學實習圃三頃園的園土(褐色砂壤土)，其苯并[a]芘的背景值為0.0302 mg/kg，有機質含量為19.29 g/kg，有效磷為5.95 mg/kg，速效鉀為271.33 mg/kg，水解氮為125.9 mg/kg。用于土壤污染處理的苯并[a]芘購于上海邁瑞爾化學技術有限公司，純度>96%。

中華人民共和國環境保護部發布的《土壤環境質量建設用地土壤污染風險管控標準(試行) (GB36600-2018)》[15]規定，第一類用地(包含公園綠地中的社區公園和兒童公園用地等)和第二類用地(包含綠地及廣場用地等)土壤苯并[a]芘濃度的篩選值分別為0.55和1.5 mg/kg，管制值分別為5.5和15 mg/kg。其中，篩選值是指污染物含量等于或低于該值的，對人體健康的風險可以忽略，超過該值后對人體健康可能存在風險；管制值是指污染物含量超過該值的，對人體健康通常存在不可接受的風險，應當采取風險管控或修復措施。依據以上規定，本試驗設置4個土壤苯并[a]芘濃度：即園土背景值(對照，CK)、5.5 mg/kg(T1)、15 mg/kg(T2)、30 mg/kg(T3)。污染土壤具體制備參考劉世亮等[23]方法：首先稱量出每個處理所需的供試土壤，根據所需要土壤的污染濃度分別計算所需苯并[a]芘的量，先用丙酮溶解所需的苯并[a]芘，加到上述所稱的少部分供試土壤中，待1～2 d丙酮揮發后，再將它們拌入全部供試土壤中，充分混勻，獲得所需的不同苯并[a]芘污染濃度土壤。1周后用于種植植物。

試驗于2020年1月15日-4月15日在北京林業大學林業科技股份有限公司試驗基地(40°01′61″N，116°35′19″E)進行，為避免空氣成分干擾，于溫室(溫度15 ℃，濕度40%左右，自然光照)中進行。定植前采集園土樣品，測定苯并[a]芘濃度，作為對照組(CK)背景值。采用80 cm×40 cm塑料容器，裝入不同苯并[a]芘濃度的土壤，1月15日在苗圃選取大小一致的植株種植并移入溫室。每個容器定植12株，設置3個重復，即每個處理共36株植物。4月15日采收植物，測量株高、根長及干重，并測定葉片的生理指標和采收后土壤苯并[a]芘濃度。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 株高、根長和干重將整株植物從土壤中取出，用自來水初步沖洗干凈，用直尺測量株高及根長。株高為植物根頸至葉片最高部位的距離；根長為植物根頸至根系最長部位的距離。用去離子水進一步沖洗整株植物后，于烘箱內烘干至恒重，稱重后得到植株干重。

1.2.2 土壤中苯并[a]芘含量采用中華人民共和國國家環境保護標準HJ784-2016[33]土壤和沉積物多環芳烴的測定-高效液相色譜法測定，并作一定調整[13]。采用超聲波提取法進行樣品的提取，而后使用柱層析凈化法，采取硅膠層析柱進行凈化，使用液相色譜儀測定。色譜柱為PAH色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；柱溫為25 ℃；流動相為水/乙腈，梯度洗脫條件為V(水)∶V(乙腈)初始值為60∶40，0.66 min后比值為60∶40，20 min后降至0∶100，27 min后升至60∶40，30 min后結束。流動相流速為2 mL/min，進樣量為10 μL。檢測器為可變波長紫外檢測器，監測波長為290 nm。采用方法空白、空白加標、基質加標、平行樣品進行質量控制。苯并[a]芘的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，最終的結果經過回收率校正。

土壤中苯并[a]芘的降低值以及去除率的計算方式如下：

苯并[a]芘降低值=土壤苯并[a]芘污染濃度-植物采收后土壤苯并[a]芘濃度；

去除率=苯并[a]芘降低值/土壤苯并[a]芘污染濃度×100%。

1.2.3 葉片光合色素含量參照Ma等[34]的方法，取新鮮植物葉片0.1 g，將葉片剪碎后浸沒在3 mL 95%乙醇中48 h，至葉片完全變成白色。8 000 r/min離心5 min后,取上清液測定其在665、649及470 nm下的吸光度，計算總葉綠素及類胡蘿卜素的含量。

1.2.4 葉片丙二醛含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[35]。取葉片0.1 g，放入預冷的研缽中，分兩次加入1 mL三氯乙酸在冰上研磨，至勻漿后倒入2 mL離心管中。4 ℃、10 000 g 離心 15 min，取上清液用于測定組織中 MDA 的含量。取2 mL離心管依次加入 0.8 mL上清液、0.8 mL 0.67% 的TBA，混勻后，將扎好孔的離心管放入恒溫水浴鍋中100 ℃煮15 min，隨后取出置于冰上冷卻10 min。再次10 000 g 離心 5 min，取出后用紫外分光光度計測定在波長450、532及600 nm 處的吸光度值，據此計算 MDA含量。

1.2.5 葉片過氧化氫(H2O2)和羥自由基(-OH)含量取葉片0.3 g，分兩次加入雙蒸水共1.5 mL，在冰上研磨至勻漿后倒入2 mL 離心管中，4 ℃、10 000 g離心15 min，取上清液。分別采用南京建成過氧化氫試劑盒A064-1-1和羥自由基測定試劑盒A018-1-1進行測定，后續步驟具體參照試劑盒說明書。

1.2.6 葉片抗氧化酶活性取葉片0.1 g，分兩次加入0.05 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.8)，在冰上研磨至勻漿，定容到10 mL后倒入離心管，在 4 ℃下10 000 g離心15 min，取上清液作為待測粗酶液。

(1)過氧化氫酶(CAT)活性：采用改進后的紫外分光光度法測定[36]。在5 mL離心管中加入200 μL粗酶液、1.5 mL pH 7.0磷酸緩沖液和1.0 mL蒸餾水；渦旋混勻，置于冰上，加入300 μL 0.1 mol/L過氧化氫溶液，迅速倒入石英比色杯中混勻，以磷酸緩沖液提取液為對照，用紫外分光光度計測定240 nm處的吸光度值；立即開始計時，每隔30 s讀數1次，共測 3 min，以此計算過氧化氫酶活性。

(2)過氧化物酶(POD)活性：采用愈創木酚法[35]測定。在試管中依次加入2.9 mL的0.05 mol/L磷酸緩沖液、1 mL 2% H2O2、1 mL 0.05 mol/L愈創木酚溶液和0.1 mL粗酶液；用95 ℃的水浴鍋煮沸5 min的粗酶液作為對照；在加了上述試劑的試管中加入粗酶液后，立即于37 ℃水浴中保溫15 min，然后迅速轉入冰浴中，并加入2 mL的20%三氯乙酸終止反應；然后5 000 g離心10 min，在470 nm波長下測定其吸光度，每1 min讀一次值，共讀3次，以此計算過氧化物酶活性。

(3)過氧化物歧化酶(SOD)活性：采用氮藍四唑 (NBT) 法[35]測定。取5 mL指形管若干支，2支為對照管，其他為測定管；依次加入0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.8)1.5 mL、130 mmol/L的甲硫氨酸溶液0.3 mL、750 μmol/L氮藍四唑溶液0.3 mL、100 μmol/L EDTA-Na2溶液0.3 mL、20 μmol/L核黃素溶液0.3 mL、上清粗酶液0.05 mL(2支對照管以緩沖液代替上清液)、蒸餾水0.25 mL，混勻，此過程在避光條件下進行?；靹蚝髮⑵渲幸恢φ展芊胖糜诤诎抵校渌鞴芊胖糜? 000 Lx燈下反應10 min，最后放置于暗盒終止反應。至反應結束后，以不照光的對照管作為空白，用紫外分光光度計迅速測定560 nm處的吸光度值。

1.3 數據處理

用Excel 2019和SPSS Statistics 25.0進行基礎數據分析，并使用Excel 2019進行圖表繪制。采用常規單因素(one-way ANOVA)和鄧肯(Duncan)法進行方差分析和多重比較(α=0.05)。圖表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 麥冬和青綠薹草對土壤中不同濃度苯并[a]芘的耐受性

兩種植物在不同濃度苯并[a]芘土壤中生長3個月后均全部成活，且從外觀看，其葉色、株型等形態與對照組差異不明顯，均可保持其觀賞價值(圖1)。植物受傷害程度和耐受性的相關生長指標(表1)顯示，兩種植物的株高、根長及生物量受土壤苯并[a]芘的影響不盡相同。其中，隨著土壤中苯并[a]芘濃度升高，兩種植物的株高、根長以及干重總體呈現降低的趨勢，但麥冬僅株高在T3(30 mg/kg)下與CK組差異顯著，其他指標各污染濃度處理均與CK組差異不顯著；而青綠薹草株高和干重在各污染濃度下均顯著低于CK組，明顯受到苯并[a]芘的抑制，但各濃度之間差異不顯著。以上結果表明雖然苯并[a]芘處理下兩種植物生長受到一定影響，但麥冬和青綠薹草均可以耐受土壤中30 mg/kg苯并[a]芘的脅迫，并保持良好的景觀效果，但麥冬對苯并[a]芘的耐受性優于青綠薹草。

表1 不同濃度苯并[a]芘土壤中植物生長變化Table 1 Changes of plant growth in soil with different concentrations of BaP

2.2 麥冬和青綠薹草對不同濃度處理土壤中苯并[a]芘的去除效率

麥冬和青綠薹草在不同濃度苯并[a]芘土壤中栽植100 d后，測定土壤中苯并[a]芘含量，與植物種植前進行對比。結果(表2)表明，隨著土壤中苯并[a]芘濃度的加大，同種植物對土壤中苯并[a]芘濃度的降低量逐漸加大，且在各處理之間均差異顯著。同時，兩種植物對苯并[a]芘去除率在各濃度處理與CK組之間均存在顯著差異，且隨著土壤苯并[a]芘濃度的升高呈現先升高后降低的變化趨勢；麥冬的去除率在T1(5.5 mg/kg)時最高(達76.9%)，而青綠薹草的去除率在T2(15 mg/kg)時最高(達79.6%)?？梢?，植物對土壤中苯并[a]芘的去除率與植物種類和土壤苯并[a]芘濃度有關。

表2 兩種植物對不同濃度處理土壤中苯并[a]芘的去除率Table 2 Removal rates of BaP in soil by two plants under different concentration treatments

2.3 土壤中苯并[a]芘濃度對麥冬和青綠薹草葉片光合色素含量的影響

土壤中苯并[a]芘濃度對麥冬和青綠薹草葉片光合色素含量的影響不同(圖2)。其中，隨著土壤苯并[a]芘濃度增大，麥冬葉片中各類光合色素含量和總含量均呈現先降低后升高的變化趨勢，并均在T2(15 mg/kg)時達到最低值，且此時除葉綠素b含量外，均與相應CK組差異顯著，而其他兩個濃度處理均與CK組差異不顯著。與麥冬的表現不同，青綠薹草葉片中各類色素含量隨著土壤中苯并[a]芘濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，并均在濃度T1

(5.5 mg/kg)時最高，但此時僅葉綠素b含量與相應CK組差異顯著，其他兩個濃度處理各色素含量和總含量均低于CK組，但差異不顯著。以上結果說明兩種植物色素含量隨著土壤苯并芘濃度的變化趨勢不同，但僅T2處理麥冬光合色素含量顯著降低，以及T1處理青綠薹草葉綠素b含量顯著增加。

2.4 土壤苯并[a]芘濃度對麥冬和青綠薹草葉片過氧化氫及羥自由基含量的影響

在不同苯并[a]芘濃度土壤中，兩種植物葉片的過氧化氫和羥自由基含量變化不同(圖3)。其中，麥冬葉片過氧化氫含量在T1(5.5 mg/kg)處理下比CK組略高，在T2(15 mg/kg)和T3(30 mg/kg)處理時顯著高于CK組；青綠薹草葉片過氧化氫含量在T1(5.5 mg/kg)處理時顯著低于CK組，在T2處理時顯著高于CK組，而在T3(30 mg/kg)處理時與CK組差異不顯著。隨著土壤苯并[a]芘濃度的升高，麥冬葉片中羥自由基含量先增加后降低，并在T2(15 mg/kg)時最高且顯著高于CK組，而其他濃度處理雖高于CK組，但差異不顯著；青綠薹草葉片羥自由基含量在各處理濃度下均顯著高于CK組，并明顯高于相應處理的麥冬?？梢?，兩種植物在土壤不同濃度苯并[a]芘脅迫下活性氧含量的響應不同，但在T2(15 mg/kg)處理時均顯著高于相應對照，且青綠薹草積累的活性氧更多。

2.5 土壤苯并[a]芘濃度對麥冬和青綠薹草葉片丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

圖4顯示，麥冬和青綠薹草葉片的POD和CAT活性在各土壤苯并[a]芘濃度處理下與對照組相比均無顯著變化；兩種植物葉片的SOD活性在各濃度苯并[a]芘下基本上比對照組不同程度升高，但僅在麥冬T1(5.5 mg/kg)處理和青綠薹草T3(30 mg/kg)處理時增幅達到顯著水平；同時，隨著土壤中苯并[a]芘濃度的升高，麥冬葉片丙二醛(MDA)含量與對照組相比無顯著變化，并始終處于較低水平；與此同時，青綠薹草葉片中MDA含量卻表現出大幅度逐漸上升的趨勢，且各濃度處理均顯著高于對照組，其中T3(30 mg/kg)處理時最高并顯著高于T1(5.5 mg/kg)處理。以上結果表明各濃度土壤苯并[a]芘污染對麥冬葉片的抗氧化酶活性和膜過氧化沒有顯著影響，耐受性較強；同時也幾乎沒有誘導青綠薹草葉片抗氧化酶活性顯著增強，從而使其受到嚴重的膜氧化損傷，MDA含量明顯高于麥冬，耐受性較弱。

3 討 論

植物株高、生物量等生長指標的變化是植物受逆境傷害的最直觀表現[37]，與植物的逆境耐性相關[38]。不同植物對土壤不同濃度苯并[a]芘有不同的耐受性，即耐受閥值不同，如5種羊茅屬植物葦狀羊茅、草原羊茅、毛稃羊茅、貧芒羊茅和細芒羊茅的耐受閾值為161.74 mg/kg[25]，浮萍為0.5 mg/kg[39]，油菜‘四月慢’為1.0 mg/kg[40]，結縷草和細羊茅分別為80和40 mg/kg[23]。在閥值內植物生長受到的抑制作用不明顯，甚至還能刺激植物的生長，但超過閥值后，植物的生長就會受到顯著抑制，這與植物自身的基因型特異性以及生理狀態有關。本研究中當土壤苯并[a]芘濃度達到30 mg/kg時，麥冬植株的生長狀況受抑制作用不顯著，其耐受苯并[a]芘的閥值可能更大，可以繼續加大污染濃度，尋找閥值；而青綠薹草在苯并[a]芘為5.5 mg/kg時生長已受到顯著抑制，其耐受閥值可能約為5.5 mg/kg。在園林中保持景觀效果的前提下，對于可以清除污染的植物種類，研究其污染物耐受閥值具有實際指導意義。

園林植物的種植可以降低土壤苯并[a]芘濃度，改善土壤質量。研究表明不同植物對土壤苯并[a]芘的去除效果不同，李軍[26]發現種植3個月后，白三葉對3.5 mg/kg的土壤苯并[a]芘去除效果最好，其次為黑麥草、細羊茅、蘇丹草和地毯草；羊茅屬的5種植物在土壤苯并[a]芘濃度為10.25～161.74 mg/kg范圍內，葦狀羊茅去除效果最好，草原羊茅、毛稃羊茅和貧芒羊茅次之，最差的是細芒羊茅[25]。本研究結果顯示，麥冬和青綠薹草對苯并[a]芘的去除效果與土壤中苯并[a]芘濃度相關，其中在低濃度(CK和5.5 mg/kg)下麥冬的去除效果優于青綠薹草，而高濃度(15和30 mg/kg)時，青綠薹草的去除效果則優于麥冬。因此評價植物對土壤苯并[a]芘的去除能力時，應該考慮具體土壤苯并[a]芘濃度才具有實踐意義。

葉綠素a和葉綠素b以及類胡蘿卜素是參與植物光合作用的主要色素，其含量是衡量植物生長狀況的重要指標之一[40]。已有研究表明苯并[a]芘對各種植物葉綠素含量的影響不盡相同，如浮萍葉綠素含量隨著苯并[a]芘濃度的升高不斷降低[41]；油菜葉綠素a和葉綠素b含量則隨著苯并[a]芘濃度的升高呈現先增加后降低的趨勢[42]。本研究中，隨著土壤苯并[a]芘濃度的增加，麥冬葉片光合色素含量呈現先降后升的變化趨勢，青綠薹草則表現出先升后降的變化趨勢，出現這種情況的原因可能是在苯并[a]芘影響下，葉綠素的合成與降解都會得到增強，但不同植物速率不同，導致兩種植物葉片葉綠素含量出現不同的變化趨勢[4]。

在逆境脅迫條件下，植物體內會積累過量活性氧，其中起重要作用的是過氧化氫和羥自由基，可以與細胞膜和蛋白質等物質發生化學反應，使膜脂過氧化產生丙二醛(MDA)[43]，造成細胞結構和功能受損[44-45]，對細胞造成不可逆轉的傷害[41,46]；而過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)是主要的活性氧清除劑[47]，其酶活性會隨著活性氧的產生而增強[48]，以減緩膜脂過氧化等傷害發生。本研究顯示兩種植物的抗氧化酶活性變化均不活躍，其中麥冬低濃度T1(5.5 mg/kg)時SOD活性顯著升高，T1處理時CAT活性、T2(15 mg/kg)處理時POD和SOD活性以及T3(30 mg/kg)時POD、SOD、CAT活性均有不同程度升高，但均未達到顯著水平；青綠薹草在低濃度T1時3種抗氧化酶活性均降低，T2處理時僅SOD活性升高但差異不顯著，僅在較高濃度T3處理時SOD活性顯著高于CK組。結合兩種植物葉片活性氧變化情況，麥冬葉片在T1處理時羥自由基含量較高，在T2處理時過氧化氫和羥自由基含量均顯著高于CK組，在T3處理時過氧化氫含量顯著高于CK組；而青綠薹草在各濃度處理下羥自由基含量均顯著高于CK組，T2處理時過氧化氫含量顯著高于CK組，與羥自由基共同作用。但是，青綠薹草葉片中膜脂過氧化的產物丙二醛含量遠高于相應的麥冬，且處理濃度間存在顯著性差異，而麥冬葉片中丙二醛含量明顯較低且處理間無顯著差異，這可能也是麥冬對土壤苯并[a]芘耐受性強的原因。至于麥冬膜脂過氧化程度低可能與其葉片內其他非酶類抗氧化物質發揮了重要作用有關，仍需進一步的探索。

綜上所述，本研究結果表明，麥冬和青綠薹草可耐受苯并[a]芘污染濃度低于30 mg/kg的土壤環境，在保持景觀效果的前提下，可有效去除土壤中苯并[a]芘；其中土壤苯并[a]芘濃度小于5.5 mg/kg時麥冬的去除效果優于青綠薹草，而高濃度(15～30 mg/kg)時，青綠薹草的去除效果則優于麥冬。麥冬對苯并[a]芘土壤污染的耐受性強于青綠薹草，這與其在各種土壤苯并[a]芘污染濃度下的光合色素含量較穩定、膜質過氧化程度較低等密切相關。