擬除蟲菊酯類農藥半抗原專利技術分析

梁艷輝，陳翠翠

(國家知識產權局專利局專利審查協作江蘇中心，蘇州 215163)

擬除蟲菊酯類農藥是一類模擬天然除蟲菊酯化學結構合成的農藥，低毒，具有無特殊臭味、安全系數高、使用濃度低、觸殺作用強、滅蟲速度快、殘效時間長等優點。擬除蟲菊酯主要應用于農業，例如防治棉花、蔬菜和果樹食葉和食果害蟲。在高毒有機磷農藥被禁止使用后，擬除蟲菊酯農藥便有了更為廣泛的應用。除此之外，擬除蟲菊酯還作為家庭用殺蟲劑被廣泛應用，用于防治蚊蠅、蟑螂及牲畜寄生蟲等。目前，人工合成的擬除蟲菊酯種類數以萬計，迄今商品化的擬除蟲菊酯有近40個品種，在全世界的殺蟲劑銷售額中占20%左右[1]。根據擬除蟲菊酯獨特的殺蟲癥狀及其對昆蟲神經鈉離子通道門控的影響，此類物質被分為Ⅰ型和Ⅱ型(圖1)。在結構上，Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲菊酯的區別主要在于醇基α-碳的位置是否存在氰基，Ⅰ型擬除蟲菊酯不存在α-氰基(例如氯菊酯、丙烯菊酯、聯苯菊酯)，Ⅱ型擬除蟲菊酯存在α-氰基(例如氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯)[2]。

圖1 I型和II型擬除蟲菊酯類農藥結構通式

由于擬除蟲菊酯類化合物具有疏水性和光穩定性，能夠長期穩定地殘留在農產品和環境基質中，進而通過生物鏈進入生物體內，嚴重危害到環境安全和人類健康，因此，檢測環境、食品、人體中擬除蟲菊酯類殺蟲劑的殘留十分必要[3]。

針對擬除蟲菊酯類殺蟲劑常用的檢測方法包括高效液相色譜法、氣相色譜電子捕獲法以及氣相色譜-質譜等。雖然這些方法的靈敏度高，但樣品需要復雜的前處理過程，分析時間長并且儀器昂貴，技術要求高，不適合大量樣品的快速檢測。隨著免疫分析技術的發展，農藥免疫分析法不但具備了與儀器分析法相當或更高的靈敏度，且無需使用昂貴儀器，方法簡便，在農藥殘留的快速篩選中已顯示出獨特的優勢。

由于擬除蟲菊酯類農藥為小分子化合物(分子量小于1 000 kD)，不具有免疫原性，因此，擬除蟲菊酯類農藥免疫檢測技術的建立，關鍵在于半抗原的涉及和改造，通過適當的化學方法加以適當的修飾，使其分子結構的某個位置上帶上端基為活性基團的連接臂，使其轉變為帶有游離氨基或游離羧基的衍生物，從而與大分子載體相連接，生成半抗原-載體的偶聯物，此偶聯物即為人工抗原。

筆者檢索了國內外涉及擬除蟲菊酯類農藥半抗原設計與合成的發明專利并對申請人、發明內容等進行梳理，以期為擬除蟲菊酯類農藥半抗原或人工抗原的研究或相關發明專利的挖掘提供參考。

1 申請人、申請量特點

從申請年度和申請量來看，全球有關擬除蟲菊酯類農藥半抗原或人工抗原的發明專利總量在100件以內，發明點涉及半抗原設計或合成的約50件，且申請時間多集中于2005-2019年，近兩年申請量較少，可見，研發熱度不是很高。國內申請人占90%以上，絕大多數為高校和科研院所，其中申請較多的申請人包括江南大學、揚州大學、南京農業大學、浙江大學、中國農業科學院油料作物研究所等，僅在2019年后出現企業申請人，例如蘇州快捷康生物技術有限公司、北京勤邦生物技術有限公司、廣州勤邦生物技術有限公司、北京望爾生物技術有限公司等。由此可見，目前擬除蟲菊酯類農藥半抗原的研究仍處于基礎研究階段，成熟的、商業化免疫檢測試劑盒較少。

2 相關專利法律狀態

對上述發明點為半抗原設計或合成的專利的法律狀態統計如表1所示，可見，目前維持有效或審查中的專利占比較小，說明相關研究主體對擬除蟲菊酯類農藥半抗原的設計和合成熱度不是很高，或者擬除蟲菊酯類農藥半抗原的設計或合成存在較難跨越的瓶頸，短期內無法獲得具有創新性的有效的半抗原化合物。由于目標物半抗原分子設計的合理性是免疫分析方法中抗體制備的關鍵，涉及半抗原結構的設計與合成的專利申請量低，因此，涉及后續人工抗原制備、載體蛋白選擇、抗原鑒定等內容的專利申請量也相應較少。

表1 涉及半抗原設計或合成專利的法律狀態

3 半抗原的設計與合成

擬除蟲菊酯農藥主要由酸結構和醇結構2部分構成，這類農藥的半抗原設計與合成根據活性基團引入位置的不同歸納為以下4類：在擬除蟲菊酯的酸或醇部分引入活性基團、對擬除蟲菊酯的氰基部分轉化引入活性基團、在末端芳香環上引入活性基團、對擬除蟲菊酯環丙烷進行修飾引入活性基團。

對檢索到的發明專利文獻的發明點進行梳理可知，擬除蟲菊酯類農藥半抗原包括特異型和通用型2種，特異型半抗原主要涉及氰戊菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、聯苯菊酯、高效/氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯等，通用型半抗原主要是根據擬除蟲菊酯的結構差異分為針對I型和Ⅱ型擬除蟲菊酯的通用型半抗原以及醚型菊酯類農藥通用半抗原。

3.1 氰戊菊酯半抗原合成

劉曙照等(CN1624480A)以氰戊菊酯的菊酸部分作為半抗原，引入長度不等的碳鏈作為間隔臂，具體為將2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰氯與氨基酸縮合獲得半抗原(圖2)。程敬麗等(CN1789238A)將氰戊菊酯的氰基水解為羧酸，引入β-丙氨酸間隔臂，然后與載體蛋白偶聯得到氰戊菊酯人工抗原。

圖2 氰戊菊酯半抗原

3.2 溴氰菊酯半抗原合成

王碩等(CN101747428A)、天津九鼎醫學生物工程有限公司(CN103529198A，專利法律狀態：有效)以二溴菊酸部分作為半抗原的基本結構，與氨基酸縮合獲得6-{[3-(2,2-二溴-乙烯基)-2,2-二甲基-環丙基羰基]-氨基}-己酸作為半抗原。王鳴華等(CN101412673A)將溴氰菊酯中的氰基轉化為羧基和含羧基的酰胺獲得溴氰菊酯人工半抗原，李相前等(CN102807614A)先將溴氰菊酯中的氰基轉化為羧基，再與3-巰基丙酸甲酯合成獲得半抗原。趙建莊等(CN1948964A)、北京農學院(CN101339189A)通過在溴氰菊酯的末端苯環上引入硝基制備半抗原，并建立了食品中溴氰菊酯農藥的間接ELISA法，靈敏度為0.100~0.237 μg/mL，線性范圍為0.015~100 μg/mL，IC50為4.786~7.709 μg/mL，回收率為86.2%~105.8%，與其他菊酯類農藥幾乎無交叉反應。

3.3 甲氰菊酯半抗原的合成

吳偉等(CN101017165A)以甲氰菊酸為半抗原，應用碳二亞胺將甲氰菊酸和牛血清蛋白偶聯，構建出甲氰菊酯人工抗原，克服了其他方法繁瑣、生產率低、特異性差等缺點。貴州勤邦食品安全科學技術有限公司(CN106918705A)公開了檢測甲氰菊酯的試紙，其中使用的甲氰菊酯半抗原合成路線如圖3所示，該半抗原通過在甲氰菊酯的末端苯環上引入具有碳鏈間隔臂的羧基，并與載體蛋白(牛血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺蛋白)偶聯獲得人工抗原，進而制備獲得試紙。該試紙檢測對茶葉樣品中的甲氰菊酯的檢測限為2 mg/kg，對茶青樣品中的甲氰菊酯的檢測限為1 mg/kg，并且與多菌靈、三唑醇、甲菌靈無交叉反應。北京勤邦生物技術有限公司(CN111735951A)則通過在甲氰菊酯的環丙烷上引入羧基制備半抗原(圖3)，并與載體蛋白(牛血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺蛋白或人血清蛋白)偶聯獲得人工抗原，進而制備獲得試紙，用于快速檢測黃瓜、蘋果等蔬菜及水果中的甲氰菊酯殘留，最低檢測限為50 μg/kg，該試紙條對500 μg/kg溴氰菊酯、氯氟氰菊酯等藥物無交叉反應。蘇州快捷康生物技術有限公司(CN110776567A)則通過在甲氰菊酯末端苯環上引入活性基團氨基，制備獲得抗甲氰菊酯單克隆抗體，甲氰菊酯試紙條靈敏度為5 ng/mL，與三氟氯氰菊酯、功夫菊酸、氯氰菊酯、溴氰菊酯、聯苯菊酯、氰戊菊酯、醚菊酯和胺菊酯這8種農藥沒有交叉反應，可見其靈敏度高、特異性良好。

圖3 甲氰菊酯半抗原

3.4 高效/氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯半抗原的合成

陳秀金等(CN103911348A，專利法律狀態：有效)將半抗原1即H1：3-氰[順-3-[2-氯-3,3,3-三氟乙基-2-二甲基]環丙烷-苯氧基]苯丙酸，通過活性酯法和血藍蛋白KLH偶聯；然后將半抗原2即H2：氰基-3-(4-氨基苯氧基)苯基-順-3-[2-氯-3,3,3-三氟乙烯基-2,2-二甲基]環丙烷酸酯，通過重氮化法和牛血清白蛋白偶聯，用作包被原；最后通過動物免疫、血清測定、細胞融合、篩選和亞克隆技術得到細胞株16號。采用小鼠體內誘生法生產腹水，然后通過辛酸-硫酸銨沉淀法純化得到相應的單克隆抗體；該抗體靈敏度高，半數抑制濃度(IC50)為(13.26±1.23) ng/mL；特異性強，為國內農產品中高效氯氟氰菊酯的殘留檢測提供了技術。

羅世能等(CN101519364A)以氯氟氰菊酯為原料，對其直接硝化，在苯環上引入硝基，進而用SnCl2·2H2O還原，制備出末端苯環上含有活性基團－NH2的半抗原CY，半抗原CY(圖4)通過重氮法成功與牛血清白蛋白(BSA)偶聯，獲得氯氟氰菊酯人工抗原CY-BSA。王利兵(CN102417468A)以對羥基苯丙酸為原料，經過7步反應，在高效氯氟氰菊酯的末端苯環上引入了以碳鏈作為連接臂的羧基。曹立民等(CN111269139A)以高效氯氟氰菊酯為原料，通過一步法將氰基轉變為氨基獲得高效氯氟氰菊酯的半抗原，并通過碳二亞胺法與活化載體蛋白偶聯獲得半抗原-OVA偶聯物，即高效氯氟氰菊酯完全抗原，用于生成多克隆抗體。該抗體對高效氯氟氰菊酯的最低檢出限為10 μg/L，對其他擬除蟲菊酯類農藥(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊酸酯)無明顯交叉反應。貴州勤邦食品安全科學技術有限公司(CN105732788A)以高效氯氟氰菊酯為原料與琥珀酸酐經一步反應在末端苯環引入活性基團羧基獲得半抗原，用間接競爭ELISA法測定相應抗體的效價為1∶100 000~150 000，并且與氯氰菊酯、氰戊菊酯沒有交叉反應，該公司還以該半抗原為基礎，申請了檢測高效氯氟氰菊酯殘留的試紙卡(CN105807056A)、檢測高效氯氟氰菊酯殘留的試劑盒(CN105807041A) 2項發明專利。

北京勤邦生物技術有限公司(CN113024415A)通過在環丙烷位置引入活性基團羧基制備得到氟氯氰菊酯半抗原(圖4)，由所述半抗原獲得的氟氯氰菊酯抗體靈敏度可達到0.1 μg/L，采用間接ELISA方法測定抗體效價，效價≥100 000，與其他菊酯類殺蟲劑(甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氰戊菊酯、聯苯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯)的交叉反應率低。

3.5 聯苯菊酯、氯菊酯半抗原合成

深圳市易瑞生物技術有限公司(CN105669482A，專利法律狀態：有效)以功夫酸為起始原料設計合成了聯苯菊酯半抗原(圖5)，基于此半抗原制備得到的檢測試紙具有特異性強，檢測靈敏度高，檢測限達到150 μg/L。

王鳴華等(CN101135683A)以聯苯醇為起始物，分別制備了聯苯菊酯半抗原2-甲基-3-苯基芐基丁二酸酯LBc、2-甲基-3-苯基苯甲酸Lby，再采用碳二亞胺法將半抗原與牛血清蛋白偶聯獲得人工抗原，經免疫動物產生特異性抗體，效價為5.12×105，對聯苯菊酯最低檢測限為0.016 mg/L，與氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯無交叉反應。張亮等(CN110850090A)以擬除蟲菊酯類殺蟲劑中間體(圖5)為原料，在環丙烷上引入帶羧基的活性基團獲得聯苯菊酯半抗原(圖5)，并制備了檢測聯苯菊酯的試紙條。該試紙條對聯苯菊酯的檢測限為15 mg/kg，對500 mg/kg氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等藥物無交叉反應。蘇州快捷康生物技術有限公司(CN109942710A，專利法律狀態：有效)設計了新穎的聯苯菊酯半抗原(圖5)，并制備了相應的單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性識別聯苯菊酯，與其他擬除蟲菊酯類殺蟲劑無交叉反應；利用本發明提供的抗聯苯菊酯抗體實現的競爭ELISA的抑制中濃度(IC50)為20 ng/mL，檢測限(IC10，LOD)為0.5 ng/mL，優于目前已報道的聯苯菊酯抗體。

日本KANKYO MENEKI GIJUTSU KENKYUSH公司(JP2001278844A)在氯菊酯的一部分導入間隔臂和能夠用于結合的官能團獲得氯菊酯的兩種半抗原化合物，式1、式2 (圖5)。

圖5 聯苯菊酯、氯菊酯半抗原

3.6 通用型半抗原合成

3.6.1 I型擬除蟲菊酯類通用型半抗原

李培武等(CN101407458A，專利法律狀態：有效)以間苯氧基苯甲醇和丁二酸酐為原料合成了I型擬除蟲菊酯類通用半抗原化合物4-羰基-4-(3-苯氧基甲氧基)丁酸，合成路線如圖6，并基于同一種半抗原發明了I型擬除蟲菊酯流動之后免疫時間分辨熒光速測試劑盒(CN106932586A)、雜交瘤細胞株QW8#及其產生的抗Ⅰ型擬除蟲菊酯通用單克隆抗體(CN106701689A)，其靈敏度高、特異性好，對醚菊酯的50%抑制濃度IC50為20.86 μg/L，對氯菊酯的50%抑制濃度IC50為24.2 μg/L，對苯醚菊酯的50%抑制濃度IC50為29.4 μg/L，對其他Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲菊酯的交叉反應率均小于1%，可應用于Ⅰ型擬除蟲菊酯的多殘留檢測。

圖6 CN101407458A中半抗原合成路線

3.6.2 II型擬除蟲菊酯類通用型半抗原

李培武等(CN101407475A)以α-氰基間苯氧基苯甲醇和丁二烯酰氯為原料合成II型擬除蟲菊酯類通用半抗原化合物α-氰基(3-苯氧基苯基)甲基-4-氯-4-羰基丁酸酯，合成路線如圖7。胥傳來等(CN101157638A)以間苯氧苯甲醛為原料，通過2步反應合成間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯，作為含氰基擬除蟲菊酯農藥的半抗原，合成路線如圖7。王立兵、胥傳來等(CN102372776A，專利法律狀態：有效)以苯醚菊酯為原料，利用高錳酸鉀和高碘酸鈉進行氧化，得到II型擬除蟲菊酯人工半抗原(圖7)，由此半抗原制備得到的抗體血清效價為32 000。匡華等(CN102901811A，專利法律狀態：有效)基于計算機分子模擬技術對擬除蟲菊酯半抗原的電荷性質和空間構象進行構建，合成了6種II型擬除蟲菊酯農藥半抗原(圖7)，預測能產生好的免疫效果的半抗原，通過免疫原的合成和免疫過程，實現識別II型擬除蟲菊酯類農藥群選擇性抗體的制備，具有很好的預測能力。奇華頓股份有限公司(CN103298337A)發明了用于確定樣品中II型擬除蟲菊酯化合物的存在的體外方法，包括使樣品中的II型擬除蟲菊酯化合物轉變成3-苯氧基苯甲酸或4-氟-3-苯氧基苯甲酸，進而用于免疫分析。

圖7 II型擬除蟲菊酯類通用型半抗原

3.6.3 醚型擬除蟲菊酯類通用型半抗原

睢可等(CN102807488A)合成了圖8所示的醚型菊酯的通用半抗原，通過間接Elisa方法檢測所述發明制備的抗原所免疫得到的抗血清對醚型菊酯的檢測靈敏度為：氯醚菊酯IC50為1.540 2 μg/mL，氟硅菊酯IC50為0.753 9 μg/mL，三氟醚菊酯IC50為0.927 4 μg/mL，并且對I型和II型擬除蟲菊酯類農藥均無交叉反應，特異性良好。

3.6.4 其他通用型半抗原

江南大學胥傳來、匡華等發明人申請了關于多件寬譜特異性半抗原的發明專利，其中CN101219965A (法律狀態：有效)以菊酸和4-氨基丁酸為原料通過2步反應合成4-氨基丁酸縮合菊酸半抗原(圖8)，用于含菊酸擬除蟲菊酯類農藥的酶聯免疫檢測。CN101726589A以3-間苯氧甲酸縮-γ-氨基丁酸(3-PBA-γ-AJDS)為半抗原與載體蛋白偶聯獲得免疫原，進而得到相應抗體，抗體檢測限為0.5~1 μg/kg，與氟胺氰菊酯、甲氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的交叉反應率為100%、18%、76%、39%、8%、7%。CN103149351A以3-苯氧苯甲酸和對硝基苯丙氨酸合成擬除蟲菊酯類農藥的通用半抗原N-(3-苯氧基苯酰)-4-氨基-L-苯丙氨酸，制備得到的膠體金免疫層析試紙條檢測擬除蟲菊酯類農藥的靈敏度分別為：氯氰菊酯50 ng/mL、甲氰菊酯200 ng/mL、順氰戊菊酯400 ng/mL，對多種菊酯農藥具有識別力， 可用于菊酯農藥多殘留的粗測。

圖8 CN102807488A中醚型菊酯通用半抗原

北京勤邦生物技術有限公司(CN107188830A，專利法律狀態：有效)設計合成了菊酯類農藥半抗原化合物(圖8)，以及該半抗原與人血清白蛋白偶聯得到的偶聯物作為免疫原免疫動物制備的單克隆抗體。經驗證，制備的單克隆抗體對溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯戊菊酯、苯氯菊酯6種菊酯類農藥具有較好的檢測靈敏度。

浙江大學的程敬麗等(CN101215247A)以二甲基菊酰氯、γ-氨基丁酸乙酯和間苯氧基甲醛為主要原料合成半抗原(圖8)。該半抗原包含了大多數擬除蟲菊酯類農藥的3個共性結構部分：雙苯氧環、帶-CN的酯和三元環結構；CN101412684A以氯氰菊酯為原料制備了高特異性擬除蟲菊酯類農藥半抗原化合物I (圖8)。中國農業科學院油料作物研究所李培武等(CN101434652A)合成了擬除蟲菊酯類農藥半抗原(圖8)，保留了擬除蟲菊酯類農藥共同具有的酯鍵結構，有利于制備出高質量抗體，抗體能夠特異識別溴氰菊酯、氯氰菊酯、功夫菊酯，與氨基甲酸酯類、有機磷類農藥無交叉反應。加利福尼亞大學(US5108900A)制備了對具有苯氧基芐基或苯氧基苯基官能團的擬除蟲菊酯類農藥具有特異性親和力的單克隆抗體，其中半抗原為苯醚菊酯的環丙烷二羧酸。

圖9 其他通用型半抗原

以上專利中，CN101219965A、CN101407458A、CN1948964A還涉及授權后專利權的轉讓，其中CN101219965A還涉及到專利權的質押，反映了這些授權專利可能存在一定的商業價值和市場活躍程度，為相關市場以后的布局和側重點提供參考依據。

4 結 語

本文總結了國內外涉及擬除蟲菊酯類農藥半抗原設計與合成的發明專利。根據上述分析可知，在專利申請方面，擬除蟲菊酯類農藥半抗原的設計與合成還有很多可以挖掘空間和很多尚待解決的問題，例如高特異性農藥半抗原種類較少，通用型半抗原制備得到的通用型抗體如何進行實際檢測應用還有待進一步研究等。在針對擬除蟲菊酯類農藥的檢測中，研究者們日益注重免疫分析技術的開發和應用，免疫分析技術將在擬除蟲菊酯類農藥殘留快速檢測中發揮越來越重要的作用。