基于網絡藥理學探討黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的活性成分與分子機制

曲信彥，高 群，潘 熠，馮汝麗，謝 龍，靳嘉麟，徐江林，曲文白，馬 征，林 謙

冠狀動脈痙攣(coronary artery spasm，CAS)[1]是指由于冠狀動脈舒縮功能異常而導致血管張力增加，出現部分或完全閉塞的病理生理狀態，為多種缺血性心臟疾病的重要病理生理基礎。冠狀動脈痙攣可作為誘發心肌缺血的獨立因素，冠心病病人合并冠狀動脈痙攣時缺血癥狀進一步加重，多中心大型調查研究結果顯示，缺血性心臟病病人麥角新堿激發試驗陽性率達43%[2]，提示冠狀動脈痙攣這一機制廣泛存在于缺血性心臟病人群中。冠狀動脈痙攣多以心絞痛為主要表現，可歸屬于中醫學“胸痹”范疇，其基本病機為氣虛血瘀，臨床上益氣活血法治療胸痹有較好療效[3]，黃芪(HQ)、丹參(DS)分別為益氣、活血代表藥物。

網絡藥理學是在系統生物學理論基礎上，對生物系統進行網絡分析，強調對信號通路的多途徑調節，具有整體性、系統性的特點，與中醫理論的整體觀念具有較強趨同性[4]。本研究擬通過網絡藥理學，預測黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的物質基礎與作用靶點，從整體分析黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的分子機制，為后續基礎研究提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 黃芪、丹參有效成分及相關靶點篩選 從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)[5]中檢索黃芪、丹參有效成分，并設定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為閾值進行初步篩選，篩選所得有效成分通過化源網數據庫(https://www.chemsrc.com)及PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)校正名稱，靶點結果通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)校正靶點信息，將有效成分、靶點導入CytoScape 3.8.2構建藥物-有效成分-靶點網絡圖，使用其內置Network Analyzer工具對有效成分的網絡拓撲參數(Degree為連接度，Betweenness為介度，closenesss為緊密度等)進行分析，依據分析結果篩選出主要有效成分。

1.2 冠狀動脈痙攣相關靶點篩選 以“coronary artery spasm”為關鍵詞，通過基因名片(GeneCards，https://www.genecards.org)數據庫篩選治療冠狀動脈痙攣的相關靶點，并于在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM，https://www.omim.org)及DRUGBANK數據庫(https://www.drugbank.com)中檢索相關靶點予以補充，合并3個數據庫靶點后刪除重復值。

1.3 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點核心靶蛋白相互作用(PPI)網絡構建 將黃芪、丹參作用相關靶點及冠狀動脈痙攣相關靶點導入在線作圖工具VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制Venn圖并得到交集靶點，將交集靶點導入STRING平臺(Version 11.0，https://string-db.org)，生物種類選擇“Homo sapiens”，以高置信度(high confidence)>0.700進行篩選，其余選項默認，得到PPI網絡模型，將其以Tsv文件格式下載后導入CytoScape 3.8.2中進一步處理得到最終PPI網絡模型，使用內置Network Analyzer工具對節點的網絡拓撲參數進行分析并篩選出主要作用靶點。

1.4 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點功能與通路的富集分析 將篩選出的主要作用靶點導入Metascape平臺(http://www.metascape.org/gp/index.html)[6]，設置P<0.01，分析其基因本體功能及代謝通路并進一步進行富集分析。

1.5 分子對接 從TCMSP數據庫下載主要有效成分的化合物結構，從PDB數據庫(https://www.rcsb.org)下載核心靶點的蛋白質結構，使用Pymol 2.2.0軟件和AutoDock Tools 1.5.6軟件對化合物、蛋白質進行處理，使用AutoDock Vina軟件對主要有效成分與核心靶點進行分子對接，通過得到的對接親和力反映結合穩固性。

2 結 果

2.1 黃芪、丹參有效成分及相關靶點篩選 檢索后初步獲得黃芪化學成分87種、丹參202種，經OB、DL篩選并剔除無靶點化學成分后最終得到黃芪有效成分17個、作用靶點206個，得到丹參有效成分59個、作用靶點130個，刪除重復值后得到有效成分76個、靶點239個詳見表1。將有效成分、靶點導入CytoScape 3.8.2構建藥物-有效成分-靶點網絡圖，結果見圖1；使用其內置Network Analyzer工具對其網絡拓撲參數進行分析，依據連接度值篩選出主要有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素等，詳見表2。

表1 黃芪、丹參有效成分

(續表)

(續表)

圖1 藥物-有效成分-靶點網絡圖

表2 主要有效成分

2.2 冠狀動脈痙攣相關靶點 檢索GeneCards數據庫、OMIM數據庫、DRUGBANK數據庫并篩選、去除重復值后共獲得冠狀動脈痙攣相關靶點2 153個。

2.3 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點PPI網絡構建 將篩選得到的黃芪、丹參作用靶點與冠狀動脈痙攣疾病靶點導入在線作圖工具VENNY 2.1后得到黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣共同靶點144個，進一步將靶點導入STRING平臺，得到黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點PPI網絡模型，將其以Tsv文件格式下載后導入CytoScape 3.8.2中進一步處理，結果見圖2，節點顏色及大小反映該靶點Degree值，依據Degree≥22(2倍中位數)篩選出主要靶點，包括蛋白激酶B1(AKT1)、腫瘤抑制蛋白P53(TP53)、白細胞介素6(IL6)等，詳見表3。

圖2 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點PPI網絡圖

表3 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣主要作用靶點

(續表)

2.4 黃芪、丹參-冠狀動脈痙攣靶點功能與通路的富集分析 將主要作用靶點導入Metascape平臺，設置P<0.01，分析其基因本體GO(gene ontology，GO)功能及代謝通路并進一步富集分析，在GO注釋分析結果中，其參與的生物學過程主要為血管生成(angiogenesis)等，分布的細胞組件主要為膜筏(membrane raft)等，參與的分子生物學功能主要為細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)等，詳見圖3、表4～表6；京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析結果主要為晚期糖基化終末產物(AGE)-糖基化終末產物受體(RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)及流體剪切應力與動脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)等，詳見圖4、表7。

圖3 GO注釋柱狀圖

表4 主要生物學過程

表5 主要細胞學組分

表6 主要分子生物學功能

圖4 KEGG主要富集通路氣泡圖

表7 主要富集通路

2.5 分子對接 將主要有效成分槲皮素、山奈酚、木犀草素與核心靶點AKT1、TP53、IL6分別進行分子對接，得出平均對接親和力為-32.604 kJ/mol，提示主要有效成分與核心靶點間具有較強的結合力。詳見表8。

表8 分子對接結果

3 討 論

冠狀動脈痙攣是由于冠狀動脈舒縮功能異常而導致血管張力增加，進而使冠狀動脈血管出現部分或完全閉塞的病理生理狀態，其作為單一因素誘發的各類心絞痛、心肌梗死及無癥狀性心肌缺血等稱為冠狀動脈痙攣綜合征[7]，而合并冠狀動脈固有狹窄時可進一步加重缺血癥狀[2]，是各類缺血性心臟病不可忽視的病理生理基礎。研究顯示，冠狀動脈痙攣的主要發病機制包括血管內皮細胞功能障礙及血管平滑肌細胞的收縮敏感性升高等[8]，其中血管內皮細胞功能障礙主要與一氧化氮(NO)、內皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)及前列環素I2(PGI2)等血管舒縮物質的合成與分泌障礙相關[9]，而血管平滑肌細胞的收縮敏感性升高主要與蛋白激酶C(PKC)[10-11]和Rho激酶(ROCK)[12]相關，但其具體調控機制仍有待進一步研究。

臨床上冠狀動脈痙攣發作時多以心絞痛為主要表現，屬中醫“胸痹”范疇，其病機多屬本虛標實，本虛以心氣虧虛為主，標實多見血瘀，兼有寒凝、痰阻等，臨床上以益氣活血法治療胸痹心痛常有較好療效[13]，黃芪、丹參作為常用益氣活血藥，其治療冠心病所致胸痹心痛機制研究相對較多[14]，但通過干預冠狀動脈痙攣進而改善缺血機制尚不確切。

本研究通過網絡藥理學篩選出黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣可能的主要有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素等。槲皮素為常見黃酮類化合物，具有舒張血管[15]、降壓[16]、抗心肌缺血[17]、改善缺血再灌注損傷[18]等心血管保護作用；研究發現，槲皮素可通過激活蛋白激酶B(AKT)，上調內皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達，進而釋放更多的NO使冠狀動脈舒張[19]；亦有研究認為其可通過抑制冠狀動脈平滑肌L型鈣通道從而舒張冠狀動脈[20]。山奈酚、木犀草素等亦有舒張冠狀動脈的作用[21-22]。

涉及的核心靶點為AKT1、TP53、IL6等，AKT1為重要的信號轉導樞紐，在心血管疾病中發揮重要作用[23]，AKT1的激活可介導eNOS合成更多的NO進而使冠狀動脈舒張[24]，其對血管內皮細胞及平滑肌細胞的增殖、遷移等方面亦有重要影響[25]；TP53的過表達可抑制血管內皮功能[26]，亦有研究認為內源性TP53對血管平滑肌細胞具有保護作用[27]，其影響冠狀動脈痙攣機制有待進一步研究； IL6為重要炎性因子，可對血管內皮細胞功能產生不利影響[28]。

涉及的主要通路為AGE-RAGE信號通路，晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)為持續高血糖狀態下一系列糖基化反應的最終產物，其與RAGE結合后激活一系列下游通路，調控eNOS、PKC等，對血管內皮細胞及平滑肌細胞功能造成影響[29-31]。流體剪切應力與動脈粥樣硬化亦為重要通路，AKT在其中通過調控內皮細胞eNOS活性對平滑肌細胞舒縮產生重要影響[32-34]。

分子對接結果提示，主要有效成分與核心靶點間具有較好的對接親和力，進一步驗證了黃芪、丹參對冠狀動脈痙攣的調控作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學初步確定了黃芪、丹參治療冠狀動脈痙攣的主要有效成分為槲皮素、山奈酚、木犀草素等，核心靶點為AKT1、TP53、IL6等，涉及的主要通路為AGE-RAGE信號通路及流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路等，為后續的基礎研究提供了指導。