基于網絡藥理學分析賈躍進老師膏方調治慢性失眠經驗

王瑞敏，劉 毅，劉 寧，李 菲，賈躍進

失眠(insomnia)指以入睡困難、睡眠維持困難或早醒，并伴有如疲勞、注意力不足和情緒不穩定等日間功能障礙為主要癥狀的疾病[1]，其患病率為10%～20%，而其中約50%為慢性失眠[2]。慢性失眠指病程>3個月的失眠[1]，通常被認為是高血壓、糖尿病、抑郁癥、焦慮癥等軀體或精神疾病的危險因素，對人體有較大危害[3-4]。現代醫學治療失眠的藥物缺乏長期療效的證據，且長期應用存在不良反應，應對慢性失眠尚無理想藥物[5-6]。膏方具有緩補慢調、治病求本的特點，擅于調治慢性疾病，且安全、有效，同時兼具較佳的口味，因此，適合慢性失眠病人的長期治療，而且通過研究名老中醫膏方調治慢性失眠的經驗有利于傳承中醫思維、推廣適宜技術、指導臨床應用、研究開發藥物。

賈躍進老師是第六批全國名老中醫藥專家工作室指導老師，臨證40余年，尤其擅長治療失眠癥、抑郁癥等精神科疾病以及應用膏方調治慢性病和亞健康狀態。鑒于膏方受中醫理論指導，其反映的信息具有大數據的特點，而其組方機制具有多成分、多靶點、多通路的復雜網絡特性，因此，本研究結合理論分析、數據挖掘及網絡藥理學方法分析賈躍進老師膏方調治慢性失眠的經驗，以反映其中體現的中醫思維、用藥規律與可能機制。

賈躍進老師膏方調治慢性失眠的思路為：①開路為先，首重三辨。正式服用膏方之前，應先服一段湯劑，名之“開路方”，其作用有三：一為利用湯劑，“湯者，蕩也”之性，較快祛除病邪，穩定、緩和病情，使病人體質易于接受膏方調治；二為調理脾胃功能，為病人更好地吸收膏方治療成分創造條件，賈躍進老師常于脾虛濕盛病人服膏方前開一些健脾化濕藥材之故，逮為此也；三為因一料膏滋常需服用1～2個月，若病人藥后不適，或藥不對癥則難以更改，恐造成損失，此時則可以“開路方”摸索對證、觀察療效，以保周全。賈躍進老師認為“開路方”尤應注重三辨，即辨病、辨證、辨體，以求能正確引導膏方的制定。使用膏方調治慢性失眠亦同理，首當根據診斷標準診斷為慢性失眠，次當辨明是何證，而對于體質，久病失眠，勢必虛實夾雜，臨床慢性失眠病人常存在肝郁、脾虛、虛火、痰濕等體質偏向，故賈躍進老師多分別投以香砂六君子湯、丹梔逍遙散、柴芩溫膽湯等方加減以扶正祛邪、調理脾胃、糾正體質。②顧護脾胃強調疏肝。中醫學在《黃帝內經》時期就構建了失眠的疾病模型，如：“衛氣不得入于陰，長留于陽，則陽氣滿，陽氣盛則陽蹻盛，不得入于陰則陰氣虛，故不目瞑[7]。”從營衛、陰陽節律周期的角度進行了闡釋；而“人以氣為主，一息不運則機緘窮，一毫不續則穹壤判”[8]，可見氣的運行直接調控著人體的生命活動，營衛、陰陽亦如是，因此賈躍進老師認為“百病生于氣”，并在此基礎上將失眠的總病機“營衛失和、陰陽不交”[9]，歸結于氣機失常，而進一步具體到臟腑，則責之與氣機相關性較大的肝、脾(胃)兩樞機。從長期失眠的臨床發病原因來看，現代人多處于一定壓力之下，情志不舒者眾，加之嗜食辛辣肥甘，易傷脾胃，同時情志失常可致肝郁而進一步侵犯脾胃，造成肝脾(胃)不調，“胃不和則臥不安”，從而失眠，而長期失眠病人的病機存在一定的變化和轉歸，主要是郁而化熱和易生痰濕等肝脾相關病理變化。膏滋中用藥較為滋膩，補益藥較多，因此在運用膏方時本就應佐以理氣健脾之品，而調治慢性失眠則更應強調，故賈躍進老師常用二陳、四君之類方加減，另輔柴胡、香附、砂仁、枳實、黨參、黃芪、麥芽、萊菔子等加強健脾行氣，合歡皮、酸棗仁、首烏藤、遠志等加強養心安神，并根據體質偏向補充對應補益藥，如是“方對證，藥對癥”，則可“陰平陽秘、精神乃治”。③時令相宜，搭配關鍵。中醫講究“人與天地相參”，認為環境、時令、氣候等對人體的生理狀態是有影響的，人應當順應自然，方能達到調治養生的目的。膏方在一年四季均可服用，而賈躍進老師則提倡冬季使用。因冬季特點是氣候寒冷，陽氣閉藏，此時人體處于抑制、收縮、降低的生理狀態，正氣最易不足，寒邪卻盛極，最易生病；加之中醫認為“冬藏精”，該令進補能使人體吸收營養物質轉化的能量，最大限度藏于體內；且冬至起九，是一年中陰氣極盛而陽氣始生的轉折點，即《易經》所言“冬至一陽生”，在此時進補有扶正固本、萌育元氣、養精蓄銳之功。對于慢性失眠病人亦是同理，“久病多虛”，冬季服用膏方可最大限度吸收藥物的治療成分，補益其虛損，顧護其脾胃，條暢其氣機，而使“正氣存內、邪不可干”。此外，膏方組分為飲片類、細料類、膠類和糖類等，其中飲片類、細料類是發揮扶正補益、祛邪療疾、健脾開胃的主要成分，亦即通過“三辨”而確定的藥物組成；糖類往往是賦形、矯味的作用；而膠類則兼具前兩者的功能。而由于糖類、膠類成分比較固定，因此在數據挖掘驗案的過程中只分析飲片及細料類藥物。

1 資料與方法

1.1 數據挖掘分析

1.1.1 數據收集 收集2015年11月10日—2020年11月10日賈躍進老師在山西中醫藥大學附屬醫院治未病中心門診診斷為慢性失眠的膏方驗案。

1.1.2 納入與排除標準

1.1.2.1 納入標準 根據《精神障礙診斷與統計手冊》(DSM-5)[10]明確診斷為慢性失眠并單純口服中藥膏方治療的安全、有效驗案(通過癥狀、隨訪、治療前后體檢指標和量表分析進行判斷)。

1.1.2.2 排除標準 診斷、效果或安全性不明確以及資料缺失的病案；合并其他影響判斷的軀體及精神病者；干預方式非單純使用中藥膏方、使用中藥其他劑型或使用膏方方式非口服者。

1.1.3 數據標準化、錄入與挖掘 通過納入與排除標準進行篩選，以雙人雙錄入法錄入古今醫案云平臺V2.2.3提供的模板中，確保準確后使用其數據標準化模塊并結合2015版《中華人民共和國藥典》[11]與第7版《中藥學》[12]對中藥進行名稱規范，如：“潞黨參”規范為“黨參”，“仙靈脾”規范為“淫羊藿”，“醋香附”規范為“香附”，“酒萸肉”規范為“山萸肉”，“懷山藥”規范為“山藥”等。獲得標準化數據后，使用數據挖掘模塊分別對其進行藥物頻次、性味歸經統計(其主要依據參考文獻[11-12])以及關聯分析、聚類分析和復雜網絡分析，并綜合獲得核心組方。

1.2 網絡藥理學分析

1.2.1 藥物有效成分及對應靶點篩選 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)分別檢索核心組方中各藥物成分，并限定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，血腦屏障(blood brain barrier，BBB)≥-0.3，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，并匹配各成分靶點，對于無靶點記錄的有效成分則利用SwissTargetPrediction平臺(http：//www.swisstargetprediction.ch/)預測靶點，最終將靶點在UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)中匹配基因名。

1.2.2 疾病靶點獲取 在Gene Expression Omnibus數據庫(GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、基因名片數據庫(GeneCards，https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM，https：//omim.org/#)、Therapeutic Target Database(TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)中分別檢索“insomnia”，得出失眠相關靶點，并將3個數據庫所得失眠相關靶點合并、去重，再利用Uniprot數據庫篩選。

1.2.3 藥物-疾病交集靶點獲取 將獲得的有效成分相關靶點與疾病相關靶點取交集，獲得核心藥物組合有效成分中直接與疾病相關的靶點。

1.2.4 疾病-藥物-成分-靶點及蛋白相互作用(PPI)網絡構建 以疾病、核心組方、藥物、有效成分和相關靶點為節點，其相互關系為邊，在CytoscapeV 3.8.0中構建網絡，并利用插件對藥物-疾病交集靶點進行PPI網絡構建、拓撲分析和聚類分析。

1.2.5 基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 將所得到的藥物-疾病交集靶點導入Cytoscape的BiNGO、ClueGO插件，分別進行GO和KEGG通路富集分析，然后將其可視化。

1.2.6 關鍵有效成分與關鍵靶點分子對接分析 選取1.2.4兩個網絡中節點度較大的關鍵成分及關鍵靶點分別在Zinc(https：//zinc.docking.org/)、RCSB蛋白質結構(PDB)數據庫中(http：//www.rcsb.org/)獲取3D結構，并使用Vina分子對接，將其中對接最好的組合使用Pymol可視化。

2 結 果

2.1 數據挖掘結果

2.1.1 藥物頻次及屬性統計 共收集到病案213例，按納入、排除標準篩選，獲得驗案122例。該122例驗案包含方劑138首，涉及中藥154味，其中藥物應用頻率>40%的有18味(見表1)。將154味中藥進行性味歸經分析，結果以雷達圖表示(見圖1)，其中，中藥藥性分布主要為平、溫；藥味主要為甘、辛、苦；藥物的歸經主要歸脾、肝、腎、肺經。

表1 138首膏方藥物使用頻次頻率(頻率>40%，n=138)

圖1 138首膏方四氣、五味、歸經頻次分布雷達圖

2.1.2 藥物關聯分析、聚類分析、復雜網絡分析及核心組方確定 將138首處方利用云平臺數據分析，設置置信度≥0.80，支持度≥0.60，得到19組藥物關聯分析結果(見表2)；將藥物使用頻率>40%的18味中藥進行聚類分析，同時設置距離類型為歐氏距離，聚類方法為最長距離法，將其分為3個聚類處方(見圖2)，C1：黃芪、當歸、白芍、合歡皮、遠志、香附、柴胡；C2：延胡索、懷牛膝；C3：黨參、半夏、莪術、薏苡仁、麥芽、山藥、陳皮、白術、茯苓；設置節點度≥150，進行中藥-中藥復雜網絡分析，得到由白術、茯苓、陳皮、山藥、麥芽、黃芪、莪術、香附、黨參9味中藥組成的核心組合(見圖3)。

表2 138首膏方藥物關聯分析

圖2 138首膏方藥物聚類分析

圖3 138首膏方核心藥物復雜網絡分析

2.2 網絡藥理學結果

2.2.1 有效成分和對應靶點 通過檢索TCMSP數據庫，結合SwissTargetPrediction預測靶點，篩選出核心組方各藥物有效成分及相關靶點。經去重、排除后，共獲得有效成分72種，重復成分5種，相關靶點476個。詳見表3。

表3 膏方核心處方部分成分相關信息

(續表)

2.2.2 疾病靶點 將GEO數據庫得到的數據集(編號：GSE122541)中的22個睡眠正常的基因表達樣本與22個睡眠剝奪的基因表達樣本用R語言進行差異分析，共得到100個差異基因靶點，見圖4。將GeneCards數據庫中得到的2 563個失眠相關基因按照相關度大于中位數進行篩選，獲得1 074個疾病靶點；此外，OMIM和TTD分別獲得295個、28個靶點。最終，共計獲得失眠靶點1 205個。

圖4 GEO數據集失眠障礙差異基因分析結果

2.2.3 藥物-疾病靶點交集結果 利用微生信平臺將獲得的藥物靶點與獲得的疾病靶點取交集，共獲得116個藥物與疾病直接相關的交集靶點。詳見圖5。

圖5 膏方核心處方藥物-疾病交集靶點

2.2.4 疾病-藥物-成分-靶點網絡和PPI網絡構建結果 將數據導入Cytoscape軟件，構建疾病-核心組方-成分-交集靶點網絡(見圖6)。從該網絡篩選出Degree>50的12個關鍵有效成分。在Bisogenet中導入116個交集靶點構建PPI網絡，然后通過CytoNCA插件得出PPI核心網絡(見圖7)，在此基礎上使用MCODE插件對核心網絡進行聚類，得出10個聚類網絡，選擇其中每個聚類網絡中節點度較大的10個靶點作為關鍵靶點(見表4)。

圖6 疾病-核心組方-成分-交集靶點網絡

圖7 交集靶點蛋白互作(PPI)網絡篩選圖

表4 關鍵成分與關鍵靶點分子對接結果

2.2.5 GO富集分析和KEGG富集分析結果 將藥物-疾病的交集靶點導入BiNGO，并設置信水平為0.01，進行GO富集分析(見圖8)，得到GO生物過程主要包括生物調節、對刺激的應答、細胞過程、代謝過程、信號過程、節律過程、免疫系統過程等；GO分子功能包括結合、分子轉導活性、催化活性等；GO細胞成分以突觸、胞外區、細胞器等為主。再將交集靶點導入ClueGO，設定P≤0.05，最小聚類為4，К-score為0.4進行KEGG通路富集分析(見圖9)，得到神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、雌激素信號通路、cAMP信號通路、TNF信號通路等。

圖8 交集靶點GO富集分析主要結果關聯圖

圖9 交集靶點KEGG關鍵通路圖

2.2.6 分子對接結果 關鍵靶點和關鍵成分分子對接結果大多≤-20.9 kJ/mol，提示關鍵成分與關鍵靶點多可能形成穩定結構(見表4)。其中對接最好的組合為AKT1與BZ1，其主要由疏水口袋與氫鍵結合(見圖10)。

圖10 AKT1與α-Amyrin分子對接構象

3 討 論

從數據挖掘結果可得，調治慢性失眠的膏方中使用頻率最高的藥物為白術、茯苓、陳皮、山藥、麥芽、黃芪、莪術、香附、黨參等。現代藥理學研究認為上述藥物具有神經保護、鎮靜催眠、抗抑郁、抗焦慮等作用，且大多數具有保肝及調理胃腸道的功效[13-23]。根據藥性、藥味、歸經分布規律分析，賈躍進老師所開膏方用藥較平和，結合頻率來看則可見其用藥略偏溫，因慢性失眠病人多存在肝脾不和的情況，脾土虧虛，賈躍進老師善用甘溫，其中甘味藥補益氣血、顧護脾胃、調和諸藥，而肝郁表現為全身氣機的失常，“氣有余便是火，氣不足便是寒”而寒熱均見，故投以辛、苦味藥，辛開苦降，通利樞機，通腑降氣，則氣機自和；藥物歸經則集中在脾、肝、肺、腎、心、胃，因脾升胃降、肝升肺降、水火既濟，皆為全身氣機運轉之樞機，尤其是前兩者，更是服用膏方與調治慢性失眠所共同強調的臟腑，此處足見賈躍進老師以調氣為先、重視肝脾、整體論治的思路。藥物關聯分析中篩選出的19對核心關聯組合是：白術、茯苓、陳皮、山藥、麥芽、黃芪、莪術、香附、黨參9味藥物的組合，其中香附為“氣中之血藥”，在行氣解郁的同時兼顧血分；莪術可破血行氣，為化瘀之要藥，有助香附行氣之功；陳皮、茯苓為二陳湯、溫膽湯、保和丸的成分，可健脾行氣、利濕安神；茯苓、白術是常用治療脾胃氣虛的藥對，四君子湯、逍遙散、參苓白術散、香砂六君子湯等類方均含此藥對；黨參補益氣血、健脾益肺，賈躍進老師常以之代人參，黃芪則可遍補三焦，益衛利水，二者可組成歸脾湯、補中益氣湯、十全大補湯等補益劑；山藥可通補脾胃肺腎，是薯蕷丸、六味地黃丸等的重要成分；麥芽則被認為是“稟受春生之氣，脾胃藥而善舒肝”，故賈躍進老師常佐以顧護脾胃并疏肝氣。綜合來看，賈躍進老師膏方調治慢性失眠，師丹溪越鞠之法，以“健脾疏肝”為主線，兼顧氣、血、痰、郁，意在治病求本。在聚類分析所得的3個聚類處方中，C1主要包括逍遙散、柴胡疏肝散、當歸補血湯等方的主要藥物及賈躍進老師常用治療失眠藥對合歡皮、遠志，體現其臨床以疏肝健脾為主旨，調治久病失眠氣血不足之法；C3方含半夏秫米湯(賈躍進老師常法鞠通而易秫米為薏苡仁)、二陳湯、四君子湯、參苓白術散、理沖湯等方中的主要藥物及賈躍進老師常用的疏肝健脾的佐使藥麥芽，反映其臨證循健脾理氣之主線，并治久病失眠而有瘀或及腎之證；C2聚類中的延胡索及懷牛膝是賈躍進老師臨床常用佐藥，兩者可增益行氣活血之功，氣血沖和則萬病不生。復雜網絡分析中所獲得的核心組方亦是關聯分析中的9味藥物。從數據挖掘可得出賈躍進老師膏方調治慢性失眠的核心組方確為白術、茯苓、陳皮、山藥、麥芽、黃芪、莪術、香附、黨參9味，此9味涵蓋了賈躍進老師膏方調治慢性失眠的主要方面，即強調肝脾、兼顧氣血、重在緩補。

根據藥物網絡構建，得出核心組方發揮作用的12個關鍵有效成分，其中SY1、SY6是兩種木脂素類成分，HQ8、HQ9皆為異黃酮類成分，橫斷面研究顯示，此兩類成分的攝入量與睡眠質量之間存在顯著的正相關[24-25]；FL4、FL5為茯苓中的三萜類化合物，研究顯示茯苓中的此類物質可發揮鎮靜作用[26]；D和E是存在于多種中藥材中的植物甾醇，前者在動物實驗中被驗證可上調谷胱甘肽、γ-氨基丁酸(GABA)水平，下調多巴胺(DA)、丙二醛、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、乙酰膽堿酯酶(AChE)水平從而調節精神癥狀、改善腦功能[27]，后者則可通過抑制TNF-α的炎癥反應來發揮神經保護作用[28]，實驗亦證實其可增加小鼠中樞神經系統(CNS)中的去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)等神經遞質從而表現抗抑郁活性[29]；EZ2是一種姜黃素衍生物，研究認為其可通過降低氧化應激而表現腦保護作用[30]；DS8被認為存在AChE抑制作用[31]，而AChE抑制劑可改善睡眠狀況[32]；XF1屬香附中的揮發油類，動物實驗得出該類物質可能通過調節膽堿能系統及5-HT水平而表現抗焦慮的作用[21]；BZ1為主要成分的混合物被研究證實具有治療抑郁的潛力[33]；B成分為主要活性成分的提取物則被實驗證實可通過抑制細胞外單胺(包括5-HT、NE和DA)的再攝取來增強中央單胺的信號傳導，從而表現抗抑郁作用[34]。

PPI網絡所得的核心靶點中，ESR1、AR分別編碼雌激素、雄激素受體，而性激素可對睡眠過程產生重要影響，雌激素和孕酮調控女性一生荷爾蒙周期相關的睡眠方式變化，雄激素則可影響晝夜節律的時相[35-36]；CREB1編碼磷酸化依賴性轉錄因子，可參與包括晝夜節律同步等多種細胞過程，并且與快速眼動(REM)睡眠在抑郁癥中的作用有關[37]；ADRB2編碼β腎上腺素能受體，該基因在清醒及睡眠剝奪時表達上調，其受體阻滯劑常會產生嗜睡等副作用[38-39]；AKT1編碼的AKT1激酶在神經元細胞間通訊、神經元存活和記憶形成中發揮作用[40]；MTNR1A編碼一種高親和力的褪黑激素(MT)受體，而MT是一種具有抗氧化、晝夜節律維持、睡眠調節和神經元存活等作用的激素，其外源性補充劑則被證明可用作失眠的替代治療[41]；NR3C1編碼糖皮質激素受體，相關報道根據觀察到的服用地塞米松病人存在睡眠障礙的副作用而認為糖皮質激素有促進清醒的作用[42]；GSK3B編碼一種糖原合酶激酶，其可作為葡萄糖穩態的負調節劑，參與能量代謝、炎癥等生理活動，而目前認為睡眠障礙與這些生理活動都有關[43-44]；此外，炎性因子TNF被動物實驗證明其增強或抑制分別促進和抑制睡眠，且在一些人類研究中亦有相同結論[45]；NTRK1編碼神經營養性酪氨酸激酶受體，可與神經營養因子結合，相關性研究表明其與抑郁、焦慮、睡眠障礙等癥狀存在相關性[46]。

目前，失眠的病理機制并不明確，但較公認的為：神經遞質調節障礙(GABA、5-HT、DA、NE等)、信號傳導障礙(下丘腦-垂體-腎上腺軸，HPA軸)、代謝障礙(能量、脂質、氨基酸及腸道微環境等)、內分泌失調(生長激素、食欲素、性激素等)、免疫功能異常(炎癥)、遺傳(基因)及心理因素刺激等引起睡眠-喚醒節律紊亂[47-49]，由GO富集分析得到的主要生物過程對上述機制幾乎均有涉及，可見膏方核心組方參與多種機制、從多個途徑對慢性失眠進行調治。KEGG通路分析主要結果中：神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、雌激素信號通路、TNF信號通路已在病理機制中概括；除此之外，cAMP的代謝產物腺苷通常被認為是睡眠的平衡調節劑[50]。分子對接結果顯示，關鍵有效成分和關鍵靶點大多可結合成穩定結構，其中與各關鍵成分對接較好的靶點為AKT1、GSK3B和NTRK1，而BZ1(α-香樹素)、DS8(蒲公英賽醇)和D(豆甾醇)則是與關鍵靶點對接較好的成分，提示核心組方中的這些成分及靶點相對更可能是賈躍進老師膏方調治慢性失眠的物質基礎，即通過AKT1激酶、神經營養因子、糖代謝調節等方面發揮作用。

綜上所述，通過對賈躍進老師膏方調治慢性失眠經驗的總結以及結合數據挖掘方法分析賈躍進老師的膏方驗案，可以得出其結合膏方特點從“肝脾”論治慢性失眠的調治思路以及包括白術、茯苓、陳皮、山藥、麥芽、黃芪、莪術、香附、黨參9味藥物在內的核心組方；進一步利用網絡藥理學方法初步預測其多成分、多靶點、多通路作用機制，得出所涉及的關鍵成分為α-香樹素、豆甾醇和蒲公英賽醇，關鍵靶點為AKT1、GSK3B和NTRK1，關鍵通路為神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸等，該結論可為臨床應用和進一步研究提供參考。