柴胡加龍骨牡蠣湯對心肌梗死合并焦慮大鼠HPA軸的影響

陳雅麗，侯季秋，王 威，靳會會，安 瑩，賈靜蕓，趙海濱

近年來，冠心病和心理疾病已成為全球發病率和致死率的主要原因[1-2]，且兩者關系密切。研究表明，心理疾病或心理情緒在冠心病病人中尤為常見，并可能與心血管疾病的發病率和死亡率大幅增加有關[2]，而患有精神疾病的病人亦有較高的患冠心病風險[3]。焦慮是心理疾病中最常見的一種心理情緒，嚴重影響人們的身心健康，也有研究證實了焦慮與冠心病病人的死亡風險增加有關[2，4-5]。由于冠心病合并焦慮發生的病理機制尚未明確，西醫臨床缺乏有效治療措施。有針對治療冠心病合并焦慮病人的研究表明，只有33.3%的焦慮癥狀能通過干預措施(包括藥物、心理咨詢、教育及替代性療法等)得到緩解[6]。

柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》，是古今慣用的經典名方。已有研究表明，柴胡加龍骨牡蠣湯能緩解心肌梗死合并焦慮障礙病人的心絞痛癥狀和焦慮狀態，總有效率達93%[7]。且研究顯示，柴胡加龍骨牡蠣湯可通過動員骨髓干細胞循環、減輕炎癥反應等方面改善心肌缺血并調節海馬區神經遞質的平衡[8-9]。本研究基于下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸從神經、體液、免疫方面探討柴胡加龍骨牡蠣湯治療心肌梗死合并焦慮的可能病理機制，為柴胡加龍骨牡蠣湯多靶點、多途徑治療心肌梗死合并焦慮提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級6周齡健康雄性SD大鼠36只，體質量170～190 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證編號：SCXK(京)2012-0001。動物飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，喂常規大鼠飼料及飲用水，本實驗獲得北京中醫藥大學倫理委員會批準(倫理審查編號：BUCM-4-2019040102-2103)。

1.2 實驗藥物 柴胡加龍骨牡蠣湯組方：柴胡12 g，黃芩9 g，龍骨15 g，牡蠣15 g，生姜9 g，黨參9 g，桂枝9 g，茯苓15 g，半夏9 g，大黃9 g，珍珠母(代鉛丹)15 g，大棗10 g。實驗使用中藥顆粒劑、配方顆粒均購自北京康仁堂藥業有限公司。

1.3 主要試劑與儀器 大鼠促腎上腺皮質激素釋放激素(CRF)酶聯免疫試劑盒(目錄號：E02C0029，BlueGene)、大鼠促腎上腺皮質激素(ACTH)酶聯免疫試劑盒(目錄號：E02A0005，BlueGene)、大鼠皮質酮(CORT)酶聯免疫試劑盒(目錄號：E02C0006，BlueGene)。小動物呼吸機(上海奧爾科特生物技術有限公司)，小動物超聲影像系統(加拿大Visual Sonics公司)，標準規格酶標儀(Thermo Scientific公司，型號：Multiskan MK3)，自動洗板機(北京拓普分析儀器有限公司，型號：DEM-3)，離心機(美國Sigma，型號：3K18)。

1.4 實驗方法

1.4.1 建模 本研究依據前期造模研究基礎[10]，采用不確定空瓶刺激法結合冠狀動脈左前降支結扎建立心肌梗死合并焦慮模型，即復合模型。

1.4.1.1 廣泛性焦慮模型 參照文獻及前期研究[10-11]，采用不確定空瓶刺激法。建模周期21 d，建模期間大鼠自由攝食。第1天～第7天進行定時喂水訓練，每日08：00～08：10和20：00～20：10給予飲水，其他時間段禁水，讓大鼠處于口渴狀態。第8天～第21天進行空瓶應激，每日早晚隨機選取一個飲水時間段給予空瓶，誘發其情緒應激，另一時間段給予喂水。

1.4.1.2 心肌梗死模型 采用左冠狀動脈前降支結扎構建心肌梗死動物模型。術前，準備小動物呼吸機，調整潮氣量為每次0.8 mL，吸呼比為1∶2，通氣頻率為80次/min。將動物稱重后用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮，消毒，固定大鼠，氣管插管，連接小動物呼吸機。在大鼠胸骨旁左側第3肋～第4肋間定位，沿肋間方向切開皮膚，長約1.5 cm，逐層分離皮下組織、肌肉，打開心包膜。用5.0縫合線，于心耳邊緣下2 mm處結扎左冠狀動脈前降支，進針深度控制在1 mm、寬度1～2 mm，收線打結。術中肉眼可見結扎線遠端左室前外側壁心肌變白區，逐層關閉胸腔。后移除呼吸機，輕捏大鼠胸廓，輔助其恢復呼吸。術后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常，4×105U青霉素預防術后感染。術中及術后大鼠蘇醒前注意保暖。術后第2天行心電圖檢查，導聯Ⅰ、aVL、V1～V6中有6個及以上導聯出現病理性Q波即為心肌梗死模型成功。假手術組穿線后打松結，余步驟相同。

1.4.1.3 復合模型 即心肌梗死合并焦慮模型[10]，在不確定空瓶刺激建模的第15天對大鼠實行心肌梗死手術，至第22天造模完成。

1.4.2 分組及給藥

1.4.2.1 分組 心肌梗死術后第2天根據心電圖Ⅰ、aVL、V1～V6導聯中的病理性Q波進行區組隨機分組。本實驗共設計4組，將心肌梗死成模大鼠分為心肌梗死組(10只)、復合模型組(心肌梗死模型合并焦慮模型，10只)、中藥組(復合模型+龍骨牡蠣湯灌胃，10只)、假手術組(6只)。

1.4.2.2 給藥 根據前期實驗中藥劑量篩選[3]，中藥組大鼠給藥量按成人(體重60 kg)的6倍劑量折算，折合大鼠日生藥劑量為13.6 g/kg，每劑中藥顆粒用蒸餾水配液為100 mL，中藥組于術后第2天給予柴胡加龍骨牡蠣顆粒劑(10 mL/kg)灌胃，每日1次；假手術組、心肌梗死組及復合模型組均于術后第2天予蒸餾水(10 mL/kg)灌胃，每日1次。至建模第22天。對大鼠進行超聲心動圖檢查及行為學實驗后處死動物，取血、心臟及海馬。

1.4.3 超聲心動圖檢測 將大鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，左前胸大面積備皮，取左心室短軸切面，探測M型曲線，每只大鼠檢測3個連續心動周期，取平均值。主要檢測大鼠的左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室射血分數(LVEF)。

1.4.4 曠場實驗(OFT) 本實驗采用體積為100 cm×100 cm×40 cm的木制黑箱，底板畫有25個正方形格子，在安靜、弱光的環境下進行。先讓大鼠適應性活動5 min，再將大鼠放在箱底中央格，開始計時并攝像，觀察6 min內大鼠的活動情況。記錄大鼠在敞箱內水平運動得分(水平運動格子數)及垂直運動得分(垂直運動次數)。

1.4.5 高架十字迷宮實驗(EPM) 該實驗裝置由兩條相對開臂(50 cm×10 cm)和相對閉臂(50 cm×10 cm×40 cm)組成，中央有一開闊區(10 cm×10 cm)，十字迷宮離地面50 cm。先讓大鼠自由活動5 min，再將大鼠面向開放臂放入，開始計時并錄像，觀察5 min內大鼠在開臂和閉臂的活動情況，記錄大鼠進入開臂次數(OE)和停留時間(OT)，進入閉臂次數(CE)和停留時間(CT)，計算OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)的比值，OE/(OE+CE)與OT/(OT+CT)的比值越大說明大鼠越傾向于待在開臂里。

1.4.6 Masson染色及尼氏染色 大鼠麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，用灌流針自左心室插入，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌流固定，摘取心臟和大腦浸泡于組織固定液中，靜置48 h后制備切片，觀察心臟Masson染色和大腦尼氏染色。

1.4.7 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測外周血CRF、ACTH及CORT含量 大鼠麻醉后，打開腹腔，撥開內臟暴露腹主動脈，用采血針進行腹主動脈采血并置于普通采血管中，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液進行檢測，根據ELISA試劑盒說明書進行指標檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。將多組獨立樣本進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，如方差齊則采用單因素方差分析，必要時采用LSD，方差不齊則采用獨立樣本秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠超聲心動圖指標比較 與假手術組比較，心肌梗死組與復合模型組LVEF及LVFS明顯下降，LVESD和LVEDD明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與復合模型組比較，中藥組LVEF及LVFS升高，LVESD和LVEDD明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見圖1。

與假手術組比較，＊ P<0.01；與復合模型組比較，# P<0.01。

2.2 4組大鼠行為學指標比較 曠場實驗結果顯示，與假手術組比較，復合模型組大鼠的水平運動得分和垂直運動得分均明顯減少，活動能力下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與復合模型組比較，中藥組大鼠水平運動得分增加，差異有統計學意義(P<0.05)。高架十字迷宮實驗結果顯示，與假手術組比較，心肌梗死組和復合模型組大鼠OE/(OE+CE)明顯下降，復合模型組OT/(OT+CT)明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與心肌梗死組比較，復合模型組大鼠OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，說明復合模型組大鼠更傾向于待在閉臂里；與復合模型組比較，中藥組大鼠OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)，說明中藥組大鼠更傾向于待在開臂里 。詳見圖2。

與假手術組比較，＊ P<0.01；與心肌梗死組比較，# P<0.05；與復合模型組比較，△ P<0.05。

2.3 4組大鼠病理染色結果比較 心肌Masson染色結果顯示：假手術組心肌細胞結構正常，肌纖維排列整齊，染色均勻；心肌梗死組和復合模型組心肌細胞壞死，局部被結締組織取代修復，可見大量成纖維細胞，心肌纖維化嚴重；中藥組心肌細胞壞死，局部被結締組織取代修復，可見成纖維細胞，心肌纖維化，但其纖維化程度明顯少于復合模型組。海馬尼氏染色結果顯示：假手術組細胞排列緊密；心肌梗死、復合模型組和中藥組細胞排列相對松散，尼氏小體數量減少；與假手術組比較，復合模型組尼氏小體數量明顯減少，與復合模型組比較，中藥組尼氏小體相對增多。詳見圖3。

圖3 4組大鼠心肌Masson染色和海馬尼氏染色結果(×400倍)

2.4 4組大鼠外周血CRF、ACTH及CORT含量比較 與假手術組比較，心肌梗死組及復合模型組外周血CRF、ACTH及CORT含量明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與心肌梗死組比較，復合模型組外周血ACTH及CORT含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與復合模型組比較，中藥組外周血CRF、ACTH及CORT含量明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4。

與假手術組比較，＊ P<0.05；與心肌梗死組比較， # P<0.01；與復合模型組比較，△ P<0.05。

3 討 論

HPA軸是神經內分泌系統的重要組成部分，在人體適應環境時發揮關鍵的調控作用。正常情況下，HPA軸在一定范圍內進行直接調節和反饋互動，以維持人體神經-體液的動態變化。應激、創傷、壓力相關性心理疾病[12-13]、心血管疾病[14]等病理性應激均能出現HPA軸功能紊亂。長期的HPA軸失調又會導致各種應激相關性癥狀及疾病。

冠心病發病率較高，也是全球人群死亡的主要病因[15]。焦慮、抑郁與冠狀動脈慢血流密切相關[16]，慢性持續性的精神壓力與冠心病的發生發展有關[17]，其內在機制可能是通過神經內分泌的調節來實現[18]。研究表明，冠心病病人持續的焦慮和抑郁癥狀是導致心血管不良事件發生的原因之一，對冠心病預后產生不良影響[19]。冠心病的發生發展與心理精神壓力關系密切，近年關于焦慮、抑郁障礙的研究，希望能從改善HPA軸功能方面治療焦慮、抑郁，但缺乏有效的基礎研究[20]。

本研究通過對模型的制備及臨床有效方劑柴胡加龍骨牡蠣湯對心肌梗死合并焦慮大鼠模型進行干預，觀察心肌梗死大鼠HPA軸的情況及柴胡加龍骨牡蠣湯對心肌梗死合并焦慮大鼠HPA軸的影響。結果顯示，與假手術組比較，心肌梗死大鼠HPA軸功能相對亢進；與復合模型組比較，柴胡加龍骨牡蠣湯能改善心肌梗死合并焦慮大鼠心功能，增加心肌梗死合并焦慮大鼠運動能力，減少壞死心肌細胞炎性浸潤；增加海馬區尼氏小體數量；能有效調控HPA軸功能，使之趨向于正常功能狀態。

綜上所述，冠心病合并焦慮與HPA軸功能失調關系密切，可能為二者共病的中間影響因素。本研究顯示了柴胡加龍骨牡蠣湯的有效性及其機制可能與調控HPA軸有關，為中藥方劑治療冠心病合并焦慮提供了一定的理論依據。但由于影響和調控HPA軸的因素眾多，尚不知柴胡加龍骨牡蠣湯是直接調控還是通過其他物質間接調控HPA軸功能，仍需進一步研究。