艾芬地爾對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦細(xì)胞NR2B亞基表達(dá)的影響及腦保護(hù)作用

李振宇，王天棟，李作鵬，張 金

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是人類致殘、致死的主要病因之一。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，靜脈溶栓與機(jī)械取栓已廣泛應(yīng)用于臨床，腦血流再通率顯著提高[1]。研究顯示，靜脈溶栓橋接機(jī)械取栓腦血管再通率可達(dá)88%[2]。然而，血流再通后所致的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)可加重神經(jīng)細(xì)胞壞死[3]。所以，再灌注后的神經(jīng)保護(hù)非常關(guān)鍵。

NR2B為N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)的亞基之一，此亞基通常表達(dá)于海馬、丘腦與前腦皮層等區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞突觸外細(xì)胞膜。正常情況下，此亞基會(huì)結(jié)合谷氨酸(glutamate，Glu)，使NMDAR活化，從而使神經(jīng)細(xì)胞得以維持正常機(jī)能。若出現(xiàn)腦缺血與再灌注，Glu過量積聚使NMDAR過表達(dá)，從而引起一系列致細(xì)胞壞死或凋亡過程即興奮性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)毒性作用[4]。艾芬地爾(Ifenprodil)是一類高選擇性NMDAR阻滯劑，對(duì)過度激活的NMDAR具有抑制作用，使其生成的興奮性毒性下降，釋放神經(jīng)保護(hù)效能[5]。本研究探討艾芬地爾對(duì)腦缺血再灌注后各階段NR2B亞基表達(dá)狀況的影響與腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠67只，9～11周齡，體質(zhì)量250～310 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(晉)2019-0004。于屏蔽環(huán)境實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，濕度40%～55%，溫度22～26 ℃，明暗光照12 h/12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料 ①艾芬地爾(上海陶素公司生產(chǎn))，將25 mg 艾芬地爾溶于0.1 L生理鹽水中制成艾芬地爾溶液；②兔抗大鼠NMDAR-NR2B多抗由北京博奧森公司生產(chǎn)；③SABC-POD[兔免疫球蛋白G(IgG)]試劑盒(即用型)、羊抗兔IgG(由生物素標(biāo)記)由武漢博士德公司生產(chǎn)；④2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京索萊寶公司生產(chǎn))，將5 g TTC溶于250 mL的0.4%磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中得到2%的TTC溶液；⑤魚線(威海漢鼎魚具公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.26 mm)，將0.26 mm型號(hào)魚線制成4.5 cm長(zhǎng)，分別于2 cm、3 cm處做標(biāo)記，頭端加熱至尖端圓潤(rùn)，并涂以硅膠，風(fēng)干24 h備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、艾芬地爾 1 h組、艾芬地爾 2 h組、艾芬地爾 3 h組、對(duì)照1 h組、對(duì)照2 h組、對(duì)照3 h組。除假手術(shù)組7只大鼠外，剩余每組10只大鼠。若造模未成功，則補(bǔ)齊各組數(shù)量。

1.4 模型制備及給藥 把大鼠置于屏蔽實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5～7 d。建模前1 d禁食，無需禁水。借助線栓法完成大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建：稱重后用10%的水合氯醛30 mg/100 g腹腔麻醉。切開頸中線偏左3 mm區(qū)域皮膚，分離筋膜及肌肉，暴露迷走神經(jīng)、頸總動(dòng)脈(CCA)及分支血管，在頸總動(dòng)脈近心端(距分叉部位約1.2 cm處)用3-0號(hào)線進(jìn)行結(jié)扎，CCA遠(yuǎn)心端、頸外動(dòng)脈(ECA)近心端分別備一縫合線，借助顯微血管夾將頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)血流阻斷，在CCA(距分叉部位約1 cm處)剪一切口，通過切口把線栓插至ICA血管夾部位，結(jié)扎CCA備線，將顯微血管夾打開，順勢(shì)緩慢勻速送入線栓，到達(dá)大腦中動(dòng)脈處可感受到阻力，插入深度為(18.5±0.5)mm。艾芬地爾 1 h、艾芬地爾2 h、艾芬地爾3 h組動(dòng)物再灌注0.5 h前[6]均腹腔注入2 mg/kg 艾芬地爾，對(duì)照組注入等量生理鹽水，假手術(shù)組不進(jìn)行處理；再灌注時(shí)剪開ECA及CCA遠(yuǎn)心端結(jié)扎線栓，在CCA遠(yuǎn)心端再次打1個(gè)松結(jié)，待撤出線栓，馬上扎緊松結(jié)；縫合皮膚；假手術(shù)組則分離CCA與分支血管，只需對(duì)CCA進(jìn)行結(jié)扎。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照Chang等[7]的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠缺血再灌注損傷后1 d的神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)分。其中，未見癥狀計(jì)0分；軀干向栓塞對(duì)側(cè)彎曲、栓塞對(duì)側(cè)前肢屈曲計(jì)1分；能夠向兩側(cè)行走，將尾部提起使其懸空，可朝栓塞對(duì)側(cè)打轉(zhuǎn)計(jì)2分；向栓塞對(duì)側(cè)行走劃圈計(jì)3分；行走費(fèi)力或無法行走計(jì)4分。將得分1～4分的動(dòng)物作為入組對(duì)象，剔除昏迷大鼠。

1.5.2 梗死體積測(cè)定 缺血再灌注1 d后，隨機(jī)從艾芬地爾 1 h組、艾芬地爾 2 h組、艾芬地爾 3 h組、對(duì)照1 h組、對(duì)照2 h組、對(duì)照3 h組中選取4只大鼠，10%的水合氯醛麻醉后斷頭法處死，取出腦部組織，用生理鹽水沖洗后立即置入-20 ℃冰箱15～20 min，以2.5 mm為厚度冠狀切腦組織，共計(jì)5片。將腦組織切片放入2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育40 min(每10 min翻面1次)后攝像，采用Image Pro-Plus 6.0軟件計(jì)算梗死區(qū)體積。

1.5.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NR2B亞基表達(dá) 制作腦組織石蠟切片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC)：脫蠟；內(nèi)源性過氧化物酶(PO)滅活；抗原修復(fù)；封閉；一抗孵育，滴加稀釋比為1∶100的一抗，4 ℃下作用10～12 h，37 ℃復(fù)溫0.5 h，PBS溶液(酸堿度7.2～7.6)沖洗3遍，每遍5 min；二抗孵育，滴加羊抗兔IgG，37 ℃下孵育0.5 h后PBS溶液(酸堿度7.2～7.6)沖洗3遍，每遍5 min；SABC孵育；顯色；復(fù)染；封片。置高倍顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，采用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損為0分。艾芬地爾 1 h組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于對(duì)照1 h組，艾芬地爾 2 h組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于對(duì)照2 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；艾芬地爾3 h組與對(duì)照3 h組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明早期應(yīng)用艾芬地爾可使腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損得到明顯改善。詳見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.2 各組腦梗死體積比較 假手術(shù)組未見梗死病灶。艾芬地爾 1 h組腦梗死體積小于對(duì)照1 h組、艾芬地爾 2 h組腦梗死體積小于對(duì)照2 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；艾芬地爾3 h組與對(duì)照3 h組腦梗死體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組腦梗死體積比較(±s) 單位：%

圖1 各組腦梗死情況

2.3 各組NR2B亞基陽性表達(dá)比較 各組動(dòng)物額葉皮層細(xì)胞漿、細(xì)胞膜中均可見NR2B亞基表達(dá)。艾芬地爾1 h組、艾芬地爾2 h組、艾芬地爾3 h組NR2B亞基表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照1 h組、對(duì)照2 h組、對(duì)照3 h組NR2B亞基表達(dá)呈上升趨勢(shì)，各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，對(duì)照1 h組與艾芬地爾 1 h組NR2B亞基表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)照3 h組NR2B亞基表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。艾芬地爾 1 h組比對(duì)照1 h組NR2B亞基表達(dá)水平低、艾芬地爾 2 h組比對(duì)照2 h組NR2B亞基表達(dá)水平低、艾芬地爾 3 h組比對(duì)照3 h組NR2B亞基表達(dá)水平低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

表3 各組NR2B亞基陽性表達(dá)比較(±s)

圖2 各組NR2B亞基陽性表達(dá)免疫組化染色(×400)

3 討 論

在醫(yī)療技術(shù)發(fā)展下，急性缺血性腦卒中血管再通率大幅提升。然而，缺血再灌注損傷卻會(huì)使腦組織遭受第二次打擊。在當(dāng)前治療腦缺血方面，最優(yōu)方案為腦血流再通和神經(jīng)保護(hù)的聯(lián)合[8]。缺血后NMDAR介導(dǎo)的興奮性氨基酸(EAA)毒性效應(yīng)是細(xì)胞凋亡、壞死的關(guān)鍵因素[9]。缺血后腦細(xì)胞功能受損導(dǎo)致大量谷氨酸在細(xì)胞周圍蓄積，使NMDAR過度活化，引起毒性效應(yīng)。NMDAR在神經(jīng)元促生存和促死亡信號(hào)通路中有雙重作用，非選擇性拮抗NMDAR，不僅能使生存信號(hào)途徑受抑，還可使神經(jīng)細(xì)胞受損，引發(fā)重度不良反應(yīng)[10]。因此，更好的選擇是單獨(dú)阻斷NMDAR的促死亡效應(yīng)，而保留促生存通路[11]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，由NMDAR引起的興奮性毒性作用主要由含NR2B亞基的NMDAR過度激活導(dǎo)致[12]，此類受體活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣離子大量蓄積，激活一氧化氮合酶、磷脂酶A2、核酸內(nèi)切酶，損傷細(xì)胞。此外，NR2B亞基同時(shí)能夠使下游促死亡信號(hào)途徑活化，造成細(xì)胞凋亡[13]。故選擇性NR2B受體拮抗劑是副作用更小、更有效的神經(jīng)保護(hù)藥物。

艾芬地爾屬于選擇性NR2B受體拮抗劑，其分子量達(dá)400.49，能夠與NR2B亞基上多胺位點(diǎn)結(jié)合，抑制后者的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，從而削弱NMDAR(內(nèi)含NR2B亞基)活性[14-15]。研究顯示，艾芬地爾可使腦缺血損傷中EAA毒性效應(yīng)減弱、減小梗死體積、緩解腦水腫，發(fā)揮腦保護(hù)效能[16-17]。但是，Araki等[17]研究大鼠全腦缺血模型的結(jié)果顯示，艾芬地爾無腦保護(hù)功能。故艾芬地爾治療腦缺血損傷的結(jié)果缺乏統(tǒng)一性，其腦保護(hù)功能尚需通過更為廣泛的研究來明確。雖然艾芬地爾作為神經(jīng)保護(hù)藥物仍存在爭(zhēng)議，但既往發(fā)表的文章多應(yīng)用在永久性缺血模型，缺血再灌注后的意義仍有待評(píng)估，且具體的作用機(jī)制不是很明確，因此，本研究探討了艾芬地爾在缺血再灌注大鼠模型中對(duì)NR2B亞基表達(dá)研究。

研究顯示，興奮性氨基酸Glu在損傷后立即觸發(fā)興奮性毒性，但在損傷后不久則開始促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，與其興奮毒性作用相比，Glu介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用更為持久[18]。研究發(fā)現(xiàn)，既往發(fā)表的研究中病人入組的時(shí)間較長(zhǎng)，缺血半暗帶幾乎消失，常導(dǎo)致陰性結(jié)果或顯示出過多的副作用[19]。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦缺血后神經(jīng)機(jī)能明顯受損，分別對(duì)比艾芬地爾 1 h組、艾芬地爾 2 h組和對(duì)照1 h組、對(duì)照2 h組發(fā)現(xiàn)，大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分減少、梗死體積減小，但對(duì)比艾芬地爾 3 h組、對(duì)照3 h組發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、梗死體積皆未見明顯不同，可見艾芬地爾可于腦缺血早期再灌注后抑制神經(jīng)功能損傷，減小腦梗死體積，若梗死時(shí)間較長(zhǎng)，則對(duì)神經(jīng)功能缺損與梗死體積無幫助。

Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射艾芬地爾能夠使大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)壓迫模型內(nèi)脊髓NR2B亞基表達(dá)量大幅下調(diào)，故判斷艾芬地爾除了可阻斷腦神經(jīng)細(xì)胞NR2B亞基，還可能對(duì)NR2B亞基表達(dá)具有抑制作用；該研究還發(fā)現(xiàn)，艾芬地爾能夠于缺血早期(2 h內(nèi))再灌注后下調(diào)NR2B表達(dá)，產(chǎn)生腦保護(hù)效能，在缺血時(shí)間增加的情況下，其雖然能夠繼續(xù)抑制NR2B表達(dá)，卻未見腦保護(hù)效能[21]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照1 h組與假手術(shù)組比較，再灌注后NR2B亞基明顯減少，此結(jié)果在艾芬地爾組更具顯著性，在NR2B亞基表達(dá)上，對(duì)照3 h組較假手術(shù)組偏高，判斷腦缺血早期血管再通后艾芬地爾的應(yīng)用可能會(huì)改善預(yù)后。

綜上所述，艾芬地爾能夠于腦缺血初期再灌注后改善缺血再灌注損傷。艾芬地爾不僅對(duì)NR2B受體具有拮抗作用，還能夠在腦缺血早期下調(diào)NR2B受體表達(dá)，從而削弱此亞基介導(dǎo)的興奮性氨基酸毒性效應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但其具體作用機(jī)制尚需通過更為深入的研究來明確。