鹽酸戊乙奎醚調控miR-183-5p表達對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

靳 濤，武 倩，董 雨，崔曉東

腦缺血或缺血性腦卒中是常見的急性腦血管疾病，嚴重威脅人類身體健康，缺氧引起的神經細胞損傷是其發病的重要因素，開發新的藥物用于神經保護對其治療具有重要意義[1-2]。鹽酸戊乙奎醚又名長托寧，是一種選擇性抗膽堿藥，作為逆轉劑和麻醉藥被廣泛應用于臨床。研究顯示，長托寧對心臟、肺、大腦等多器官具有保護作用[3]。研究顯示，長托寧對大鼠內毒素性腦損傷后血腦屏障通透性具有保護作用[4]。長托寧預處理可通過抑制海馬組織細胞外信號調節激酶的(ERK)1/2激活而減輕小鼠反復缺血-再灌注腦損傷并改善其學習記憶能力[5]。長托寧可能通過抑制肺組織氧化應激和細胞凋亡，減輕新生大鼠內毒素性急性肺損傷[6]。然而長托寧對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響及機制尚不明確。研究表明，微小RNA(miRNA)參與缺血性腦卒中的一系列病理生理過程[7]。缺血小鼠神經母細胞瘤細胞N2A細胞中miR-183-5p表達降低，miR-183-5p過表達，通過負調控張力蛋白同源物(PTEN)減輕腦缺血損傷[8]。上調miR-183-5p表達可抑制炎癥反應和氧化應激，減輕腦出血后的早期損傷[9]。因此，本研究探討長托寧對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響及其與miR-183-5p的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞株(貨號：XB-3033，上海奧陸生物科技有限公司)；RPMI-1640培養基(貨號：YB150110B，上海鈺博生物科技有限公司)；長托寧(貨號：100931，上海彩佑實業有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號：1531704953)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號：1533806644)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：1534619774)均購自上海江萊生物科技有限公司；細胞凋亡試劑盒(貨號：A025，美國GeneCopoeia公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號：AR0102)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號：AR0146)均購自武漢博士德生物工程有限公司；TaqMan MicroRNA定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(貨號：MTTXXXXX-ZCO，北京百奧萊博科技有限公司)。

1.2 細胞處理與分組 PC12細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基在37 ℃、95%O2、5%CO2條件下培養作為對照組；將PC12細胞置于37 ℃、1%O2、94%N2、5% CO2條件下培養24 h作為缺氧組；分別用0.01 μmol/L、0.03 μmol/L、0.10 μmol/L的長托寧處理PC12細胞，再進行缺氧處理，作為缺氧+長托寧低、中、高劑量組；將miR-NC、miR-183-5p轉染至PC12細胞后進行缺氧處理，作為缺氧+miR-NC組、缺氧+miR-183-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-183-5p轉染至PC12細胞后，經0.1 μmol/L的長托寧處理，再進行缺氧處理，作為缺氧+長托寧+anti-miR-NC組、缺氧+長托寧+anti-miR-183-5p組。

1.3 LDH漏出率、SOD活性、MDA含量的檢測 收集各組細胞及細胞培養上清液，根據試劑盒說明書方法，檢測細胞培養上清液中LDH漏出率以及細胞中SOD活性、MDA含量。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各組細胞，漂洗后加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，混勻，避光孵育10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 RIPA裂解液提取總蛋白、BCA測定蛋白濃度；蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、封閉，將膜放入雜交袋中，倒入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，倒掉一抗，洗膜；加入稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫搖床孵育2 h，洗膜后用電化學發生(ECL)法顯色，暗室顯影、定影。Quantity-One分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參分析蛋白相對表達水平。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測miR-183-5p表達水平 提取細胞總RNA后反轉錄成cDNA，用TaqMan MicroRNA定量PCR試劑盒檢測miR-183-5p相對表達水平，以U6為內參，采用2-△△Ct公式進行計算。miR-183-5p正向引物序列：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′，反向引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

2 結 果

2.1 長托寧對缺氧誘導PC12細胞氧化應激的影響 與對照組比較，缺氧組LDH漏出率增多、SOD活性降低、MDA含量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+長托寧低、中、高劑量組LDH漏出率依次減少、SOD活性升高、MDA含量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；缺氧+長托寧低、中、高劑量組LDH漏出率減少、SOD活性依次升高、MDA含量依次降低，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 長托寧對缺氧誘導PC12細胞氧化應激的影響(±s)

2.2 長托寧對缺氧誘導PC12細胞凋亡的影響 與對照組比較，缺氧組PC12細胞凋亡率升高、Bcl-2蛋白表達水平降低、Bax蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+長托寧低、缺氧+長托寧低中、缺氧+長托寧低高劑量組PC12細胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表達水平升高、Bax蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；缺氧+長托寧低、中、高劑量組PC12細胞凋亡率依次升高、Bcl-2蛋白表達水平依次降低、Bax蛋白表達水平依次升高，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 長托寧對缺氧誘導PC12細胞凋亡的影響

表2 長托寧對缺氧誘導PC12細胞凋亡的影響(±s)

2.3 長托寧對缺氧誘導PC12細胞中miR-183-5p表達的影響 與對照組比較，缺氧組miR-183-5p表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+長托寧低、缺氧+長托寧中、缺氧+長托寧高劑量組miR-183-5p表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；缺氧+長托寧低、中、高劑量組miR-183-5p表達水平依次升高，組間差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 長托寧對缺氧誘導PC12細胞中miR-183-5p表達的影響(±s)

2.4 miR-183-5p過表達對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和凋亡的影響 與缺氧+miR-NC組比較，缺氧+miR-183-5p組miR-183-5p表達水平升高，LDH漏出率減少，SOD活性升高，MDA含量降低，PC12細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2及表4。

圖2 miR-183-5p過表達對缺氧誘導PC12細胞凋亡的影響

表4 miR-183-5p過表達對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和凋亡的影響(±s)

2.5 抑制miR-183-5p表達對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和凋亡的影響 與缺氧+長托寧+anti-miR-NC組比較，缺氧+長托寧+anti-miR-183-5p組miR-183-5p表達水平降低，LDH漏出率增加，SOD活性降低，MDA含量升高，PC12細胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3及表5。

圖3 抑制miR-183-5p表達對缺氧誘導PC12細胞凋亡的影響

表5 抑制miR-183-5p表達對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和凋亡的影響(±s)

3 討 論

腦缺血后可發生氧化應激、神經細胞凋亡、炎癥反應等一系列病理過程，進而引起神經細胞損傷[10-11]。PC12細胞是研究腦缺血損傷常用的細胞模型，本研究用缺氧誘導PC12細胞模擬腦缺血細胞損傷。研究報道，長托寧對小鼠腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，其可抑制炎性因子的釋放和氧化應激的產生[12]。長托寧通過減輕細胞凋亡和內質網應激減輕脂多糖誘導的急性肺損傷[13]。長托寧抑制細胞凋亡和氧化應激，對缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷具有保護作用[14]。本研究結果顯示，不同劑量長托寧處理后，缺氧誘導PC12細胞中LDH漏出率減少、SOD活性升高、MDA含量降低、PC12細胞凋亡率降低、Bcl-2蛋白表達水平升高、Bax蛋白表達水平降低，表明長托寧可抑制缺氧誘導PC12細胞的氧化應激和細胞凋亡。

研究顯示，過表達miR-183-5p可抑制缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡[15]。miR-183-5p的過表達增加了應激條件下神經元的存活率，在肌萎縮性側索硬化癥中保護神經元免受細胞死亡[16]。本研究結果顯示，缺氧誘導PC12細胞中miR-183-5p表達水平降低，miR-183-5p過表達降低了缺氧誘導PC12細胞中LDH漏出率、MDA含量，提高了SOD活性，降低了細胞凋亡率，表明miR-183-5p過表達具有抗缺氧誘導PC12細胞氧化應激和凋亡的作用。且本研究還發現，長托寧處理可提高缺氧誘導PC12細胞中miR-183-5p表達水平，而抑制miR-183-5p表達逆轉了長托寧對缺氧誘導PC12細胞氧化應激和凋亡的作用。

綜上所述，長托寧可能通過上調miR-183-5p表達抑制缺氧誘導PC12細胞氧化應激和細胞凋亡。