骨橋蛋白及TNF-α診斷阿爾茨海默病的臨床價值

劉 婷，孟新玲，李 丹，馬 娜，杜 帥，張玉潔

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，占老年癡呆的50%～75%，其發病率隨著世界人口的老齡化迅速攀升[1]。AD的發病機制復雜，尚無一種學說能夠比較全面、合理地闡明其發病過程，除了已知的淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解而成的Aβ多肽片段假說外[2]，近幾年研究證實多種免疫細胞和炎性因子可以通過各種方式參與疾病發展，并與沉積的Aβ相互作用，觸發一系列神經病理反應，如Tau蛋白過磷酸化和神經原纖維纏結形成和神經元損傷，最終導致廣泛的神經退行性病變和癡呆[3-4]。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種炎性因子，在各種慢性炎癥和自身免疫疾病中發揮重要作用。既往的體內和體外實驗表明，骨橋蛋白表達的增強很可能是應對加速的神經退行性變和病理性變化的反應[5-6]。但有關結果多局限在動物實驗階段，臨床上確切的炎癥致病機制尚未完全明確。因此，本研究的目的是評估骨橋蛋白水平以及各炎性細胞因子在診斷AD上的應用價值以及隨訪期間的變化情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性分析2016年11月—2019年3月新疆維吾爾自治區中醫醫院收治的AD以及同期非炎癥性神經病(noninflammatory neurologic diseases，OND)病人120例，分為AD組和OND組，每組60例。隨訪1年。本研究通過醫院倫理委員會審查，所有病人均由家屬簽署知情同意書。

1.2 診斷標準 AD的診斷參照美國神經病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關疾病學會工作組(NINCDS-ADRDA)標準中“很可能阿爾茨海默病(probable Alzheimer′s disease with mild tomoderate dementia)”的診斷標準[7]。OND組選擇同期住院的非炎癥性神經系統疾病的病人，如緊張型頭痛、低鉀性周期性麻痹。

1.3 納入與排除標準

1.3.1 納入標準 結合臨床表現及影像學檢查明確診斷為AD病人；年齡≥50歲；既往無腫瘤及精神疾病等病史者；視聽功能完好，可完成記憶量表檢測，無認知功能障礙者；簽署知情同意書者。

1.3.2 排除標準 入院時患精神病或神經障礙；頭部損傷導致的意識喪失者；酒精或藥物濫用者；伴隨可能影響免疫水平疾病的病人，如糖尿病、嚴重的肺炎、自身免疫性疾病類、風濕性關節炎、急性或慢性炎癥疾病等；伴隨有重大軀體疾病并危及生命者，如急性心肌梗死、嚴重的慢性阻塞性肺疾?。皇褂妙惞檀计べ|激素及非甾體類抗炎藥物者；隨訪資料不全或中途退出研究者；拒絕簽署知情同意書者。

1.4 方法 入院后收集病人年齡、性別、體質指數(BMI)、簡易精神狀態檢查量表(MMSE)評分等臨床資料。采集病人腰椎穿刺留取的腦脊液樣本、晨起空腹靜脈血，-80 ℃保存，避免樣本反復凍融。運用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清和腦脊液中骨橋蛋白含量，血清白細胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-17A、轉化生長因子-β1(TGF-β1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平(ELISA試劑盒購自美國R & D公司)。所有入選病人均通過門診和住院隨訪1年，隨訪時間始于病人接受治療的日期，止于病人死亡或隨訪截止日期，對失訪病例按最后1次隨訪時間為準做刪失處理。隨訪1年后，再次檢測血清骨橋蛋白及IL-1β、IL-6、IL-17A、TGFβ-1和TNF-α水平，進行MMSE測評。對比分析隨訪前后各指標差異，以及評估MMSE評分、骨橋蛋白以及各細胞因子的相關性。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 隨訪1年后，AD組失訪12例，OND組失訪9例。AD組MMSE評分低于OND組，腦脊液骨橋蛋白、血清骨橋蛋白、TNF-α水平高于OND組，差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組隨訪1年后各指標比較 隨訪1年后，AD組MMSE評分低于OND組，血清骨橋蛋白、TNF-α水平高于OND組，差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見表2。

表2 兩組隨訪1年后各指標比較(±s)

2.3 AD組炎性因子與疾病嚴重程度的相關性分析 相關性分析顯示，腦脊液骨橋蛋白水平與MMSE評分呈正相關(r=0.865，P<0.001)，血清骨橋蛋白水平與MMSE評分呈正相關(r=0.853，P<0.001)，TNF-α水平與MMSE評分呈負相關(r=-0.776，P<0.001)。詳見圖1～圖3。

圖1 腦脊液骨橋蛋白水平與MMSE評分的相關性

圖2 血清骨橋蛋白水平與MMSE評分的相關性

圖3 血清TNF-α水平與MMSE評分的相關性

ROC分析結果顯示，腦脊液骨橋蛋白、血清骨橋蛋白和TNF-α的曲線下面積(AUC)分別為0.981[95%CI(0.921，0.993)]、0.920[95%CI(0.862，0.971)]和0.910[95%CI(0.850，0.970)]，敏感度分別為90%、85%和83%，特異度分別為91%、83%和83%。腦脊液骨橋蛋白的ROC曲線下面積明顯高于血清骨橋蛋白和TNF-α的曲線下面積(P<0.001)。詳見表3、圖4。

表3 不同標記物評估AD的ROC曲線分析

圖4 腦脊液、血清骨橋蛋白及血清TNF-α診斷AD的ROC曲線

3 討 論

AD病人的免疫炎癥反應是指腦中固有免疫細胞如小膠質細胞、星形膠質細胞等表達和釋放大量神經炎癥介質，包括補體激動劑和抑制劑、趨化因子、細胞因子、氧自由基和炎癥酶系統，這些炎癥介質通過各種方式促進淀粉樣蛋白前體蛋白加工進而損傷神經末梢活性引發突觸功能障礙，促進神經元損傷，該過程一旦啟動，將對AD進程產生持續影響[8-9]。因此，本研究擬評估骨橋蛋白和炎癥相關因子與AD病情進展之間的相關性分析。從而在免疫炎癥角度上揭示該疾病的發病機制及病情發展規律，進而為AD的治療提供新的思路和相應的理論基礎。

本研究結果橫向研究顯示，AD組較OND組無論在入院時還是隨訪1年，均具有較高的血清TNF-α和骨橋蛋白水平，這與既往研究相似，研究認為人腦中所含有小膠質細胞和星形膠質細胞可以被感染，炎癥性疾病，局部缺血和創傷性損傷等中樞神經系統的各種病理過程激活而分泌大量TNF-α等炎性因子[10]，并且對AD病人死亡后的大腦分析發現，TNF-α可以定位在淀粉樣斑塊中[11]。本研究顯示，入院時AD組的腦脊液中骨橋蛋白水平較OND組明顯升高，這可能與剛診斷為AD時，炎癥反應主要發生于內嗅、顳頂葉和扣帶回皮質等腦脆弱區，引起急性期蛋白和促炎介質的表達增加有關。而腦脊液內的炎性因子可以直接接觸大腦，能準確反映中樞神經系統正在進行的炎癥過程，因此，腦脊液骨橋蛋白水平的反應時間早于血清骨橋蛋白水平[12]。同時橫向研究還顯示，隨訪前后兩組之間其余的炎性因子水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。何璐等[13]進行的70 種免疫及炎癥相關蛋白研究也證實，AD組和健康對照組之間除TNF-α外，其余常見的如IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17A等炎性因子比較差異均無統計學意義(P>0.05)。但也有研究和薈萃分析顯示，AD病人外周血中IL-6、IL-8、IL-10等濃度明顯高于健康對照組[14-16]。這可能與各研究之間存在種族差異以及檢測手段和平臺的差異有關，并且本研究嚴格排除了AD 以外其他可能影響免疫炎癥水平的各種相關伴隨疾病。但本研究中縱向隨訪研究顯示，AD組隨訪前后MMSE評分無明顯變化，并且各炎性指標之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，這與既往研究相似。Julian等[17]進行的一項為期2年的隨訪研究顯示，診斷AD病人的各項炎性因子比較差異均無統計學意義(P>0.05)。故不是所有的血清炎性細胞因子的改變都可以預測AD病人認知功能的下降，還需進一步大樣本研究發現確切的預測標記物。

相關性分析也證實AD組腦脊液和血清骨橋蛋白水平與認知障礙嚴重評分呈正相關。本研究ROC曲線分析結果顯示，腦脊液和血清骨橋蛋白水平、TNF-α在預測AD上具有較高的敏感度和特異度，這與既往研究相似。Comi等[18]研究表明，MMSE評分>23分的AD病人腦脊液骨橋蛋白含量明顯高于MMSE評分≤23分的病人，這可能與認知功能下降有關。盡管骨橋蛋白是AD病人認知功能減退的關鍵促炎細胞因子，但其確切作用及其潛在機制尚不清楚。Th17細胞已被證明是各種炎癥和自身免疫疾病的致病效應細胞。動物研究顯示，骨橋蛋白通過抑制小鼠樹突狀細胞中IL-17A的分泌，在Th17細胞的分化過程中發揮關鍵作用[19]。也有研究顯示，AD病人Th17 細胞增加，骨橋蛋白水平升高可能通過增強活化T細胞的存活而加劇AD病人腦中出現的異常免疫反應[20]。此外還有研究發現，骨橋蛋白在AD病人海馬CA1區錐體細胞中的表達增強，骨橋蛋白染色強度與淀粉樣β蛋白負荷和年齡呈正相關[21]。動物實驗研究發現，Aβ誘導的AD模型鼠血清和腦脊液骨橋蛋白同時升高，且與病程相關；外源給予骨橋蛋白能夠改善Aβ誘發的小膠質細胞反應[22]。這些研究均表明骨橋蛋白在神經退行性疾病的發展過程中可能有兩種相反的作用。一方面，骨橋蛋白通過上調髓鞘形成和再髓鞘形成發揮神經保護劑的作用；另一方面，骨橋蛋白通過引起神經元毒性和死亡而具有疾病加速作用[23-24]。

結合本研究和既往研究推測，TNF-α和骨橋蛋白可能是一種新的潛在的AD生物學標志物，并在AD的病理生理機制中發揮重要作用。但本研究為單中心研究，在排除標準上限制了大量會影響免疫功能的因素，以及部分病人在隨訪資料不全，導致AD的發病率有可能被低估；其次，本研究僅評估了少量炎性細胞因子的變化情況，由于檢測指標和平臺的差異，仍需進一步擴大檢測指標進行綜合分析；本研究隨訪1年后未能收集腦脊液中骨橋蛋白變化情況，因此仍需進一步研究證實該結論。

綜上所述，TNF-α和骨橋蛋白與AD病情的嚴重程度密切相關，在診斷AD上均具有更高的敏感性和特異性，可以作為AD的潛在生物標志物組合。但對于其他炎性因子與AD病情嚴重程度的關系仍有待于進一步研究。