五種中草藥提取物對致齲菌的體外抑菌作用研究

胡洋，宇翔，陶茜，陶玉玲

（江西省婦幼保健院，南昌 330006）

齲齒是在以細菌為主要因素的多種條件影響下，牙體硬組織發生慢性進行性破壞的一種疾病，常繼發牙髓炎和根尖炎，嚴重者引起牙槽骨和頜骨炎癥；其發病率高，分布廣，嚴重危害人群身心健康[1-2]。本研究擬在體外將中藥提取物作用于常見致齲菌，為進一步研究其防病機制提供依據。前期，通過查閱文獻，選擇黃連、金銀花、厚樸、桔梗與大黃五種中草藥，提取其有效成分，進行體外抑菌試驗，為將中草藥對致齲菌的抑菌作用應用于實踐提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材提取液的制備 將用于實驗的中草藥：黃連、金銀花、厚樸、桔梗與大黃按照標準方法分別提取主要成分。

1.1.2 實驗菌種及培養基 變形鏈球菌、粘性放線菌ATCC19246；BHI培養基(Brain Heart Infusion)；輕唾瓊脂培養基(Mitis-Salivarusagar，MS)；普通血瓊脂培養基。

1.1.3 含提取液紙片的制備 選中性定性濾紙，用打孔器打成6 mm圓片，分裝于潔凈干燥的玻璃平皿內，干熱120℃，2 h滅菌備用。放50片紙片于平皿中，在無菌環境下加藥液1 mL，置冰箱內浸泡過夜，然后置于冷凍真空干燥機內抽干，4℃密封保存。

1.2 方法

1.2.1 抑菌圈直徑的測定 將變形鏈球菌、粘性放線菌分別接種于3 mL BHI培養中，37℃厭氧培養18 h。用麥氏比濁標準，調節其濃度為108CFU／mL，取50μL接種于MS培養基上，然后夾取含中草藥提取液的紙片放在瓊脂表面，輕壓紙片，使各紙片間間距相等。37℃厭氧培養48 h，測各紙片的抑菌圈大小。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)測定 在2 mL BHI培養基中分別加入倍比稀釋的中草藥提取液（終濃度為原液的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍），接種變形鏈球菌和粘性放線菌0.5 mL(108CFU／mL)。制備的中藥提取液，分別取50μL按濃度由低到高依次加入96孔板中。分別取備用菌液50μL加入已加藥的孔中，另設無菌對照孔和無藥對照孔。振蕩1 min混勻后，37℃厭氧培養48 h。凡肉眼觀察無細菌生長，即試管內液體清亮，無混濁或沉淀生長的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

2 結果

2.1 五種中藥提取物的抑菌圈比較 以抑菌圈大于9 mm為陽性結果，厚樸、黃連、大黃對變形鏈球菌與粘性放線菌有較大的抑制作用，金銀花與桔梗抑菌圈直徑小于9 mm。五種中藥黃連、金銀花、厚樸、桔梗與大黃提取液對致齲菌的抑菌圈直徑比較，見表1。

表1 5種中藥提取物對致齲菌的抑菌圈直徑比較（mm）

2.2 中藥提取物對致齲菌的最小抑菌濃度 中藥厚樸、黃連與大黃提取物對變形鏈球菌的最小濃度分別為為1.25 mg/mL，5 mg/mL與5 mg/mL；厚樸、黃連與大黃提取物對粘性放線菌的最小抑菌濃度為0.63 mg/mL，1.25 mg/mL與2.5 mg/mL。結果顯示中藥厚樸提取物對常見致齲菌變形鏈球菌和粘性放線菌抑菌作用強于黃連與大黃，見表2。

表2 中藥提取物對致齲菌的最小抑菌濃度（mg/mL）

3 討論

兒童是齲病的易感人群，早期嬰幼兒齲對兒童口腔健康危害很大。根據第四次全國口腔流行病學調查顯示，我國5歲兒童乳牙患齲率高達70.9%，且近年來有上升趨勢，嚴重影響兒童的健康成長[3]。

齲病是細菌、食物、宿主和時間共同作用的結果，致齲菌在其發生過程中發揮重要作用。致齲菌主要包括變形鏈球菌，放線菌屬等[4]。致齲菌定植于牙齒表面形成牙菌斑，在形成過程中，多種細菌互相作用生成生物膜，導致耐藥性提高；早期曾采用抗生素治療齲病，但研究發現，長期使用抗生素可引起耐藥，從而誘發菌群失調，產生不良后果[5-6]。

齲齒的治療方法有多種，包括磨除法、藥物療法等，療法各有利弊。目前，人們開始注重齲病的預防，采用的方法有在牙膏中加入一定濃度的氟化物，但對于吞咽控制發育不完善的低齡兒童，存在誤吞食氟的危險，在一定程度上限制了應用[7]。因此，尋找安全有效的天然制劑成為齲病預防領域的研究熱點。從傳統中藥中選擇具有清熱解毒、抑菌殺菌作用的中藥用于防治齲病，為齲病的防治開辟了一條重要途徑。

本實驗采用紙片法和液體二倍稀釋法測定了黃連、大黃、金銀花、桔梗、厚樸五種中藥提取物對變形鏈球菌及粘性放線菌的體外抑菌作用。研究發現，黃連，大黃、厚樸對變形鏈球菌和粘性放線菌有較好的抑菌作用，且厚樸的抑菌作用強于黃連與大黃。

以往研究報道[8-9]，黃連的主要成分包括多種生物堿，包括小檗堿、黃連堿等，對常見致齲菌的生長有較強的抑制作用，部分成分有抗炎解毒和免疫調節作用；大黃的主要化學成分為蒽醌類化合物，藥理作用廣泛，抗菌有效成分是大黃酸、大黃素，能抑制細菌核酸的生物合成過程，此外，鞣酸也有一定的抗菌作用，可抑制口腔中常見致齲菌的生長，降低牙菌斑的聚集；厚樸的有效成分為厚樸酚，抗菌作用明顯，對懸液中及吸附在實驗性牙菌斑上的變形鏈球菌生長均有很強的抑制作用。從篩選出的中藥看出，中藥生物堿類（黃連中的小檗堿）、蒽衍生物類（大黃中的大黃酸）、木脂素類（厚樸中的厚樸酚）的活性成分中均可發掘出有效抗致齲菌物質。本研究所選中藥資源廣、價格低廉、毒副作用低，在齲病防治方面具有廣闊前景，但對具體有效成分及作用機制還需要進一步分析。