基于STAT3通路探討芍藥苷對垂體瘤細胞增殖凋亡的影響

徐大偉，刁玉領，惠 磊，周文科，汲乾坤

垂體瘤是顱內常見的良性腫瘤，發生率占顱內腫瘤的10%～15%，僅次于腦膠質瘤和腦膜瘤，居第3位[1]。垂體瘤形態學表現為良性，但部分腫瘤呈侵襲性生長，可侵入鄰近組織，引起各種并發癥，影響病人內分泌及神經功能。垂體瘤具有惡性腫瘤特征，瘤細胞惡性增殖和侵襲性與復發及預后密切相關[2]。目前，垂體瘤的治療方法主要包括手術、藥物和放射，手術治療引起一系列后遺癥與并發癥，放射治療對垂體功能損傷較大[3]。因此，研發安全有效的藥物意義重大。芍藥苷是從毛茛科植物芍藥中提取的一種單萜類葡萄糖苷化合物，是芍藥的主要活性單體成分，具有抗炎、鎮痛、抗氧化應激、擴張血管、神經保護等藥理作用[4-5]。有研究顯示，芍藥苷對神經膠質瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌等具有良好的抗腫瘤活性[6]。目前，關于芍藥苷治療垂體瘤的研究報道較少。本研究以人垂體瘤細胞為實驗對象，探討芍藥苷對垂體瘤細胞增殖凋亡的影響及作用機制，為芍藥苷相關藥物的研發及垂體瘤的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 垂體瘤組織 垂體瘤標本由新鄉醫學院第一附屬醫院神經外科提供，經臨床表現和病理組織學檢查，手術中取新鮮垂體瘤組織塊置于無菌生理鹽水中，4 ℃保存。本研究經醫院倫理委員會審核批準，且通過病人知情同意。

1.1.2 實驗藥品及試劑 芍藥苷(HPLC>98%，上海融禾醫藥科技發展有限公司)；四唑鹽(MTT，美國Sigma公司)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒及核蛋白提取試劑盒(南京凱基公司)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；鼠抗人Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)一抗、兔抗人磷酸化JAK2(p-JAK2)一抗、鼠抗人信號傳導及轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription，STAT3)一抗、兔抗人磷酸化STAT3(p-STAT3)一抗(美國Thermo Fisher Scientific公司)；鼠抗人B淋巴細胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)一抗、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗和鼠抗人β-actin一抗(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、HRP標記的羊抗鼠二抗(英國Abcam公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，蛋白凝膠電泳儀(上海天能科技有限公司)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)儀(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 垂體瘤細胞的分離與培養 取新鮮垂體瘤組織，去除結締組織、壞死組織及血塊，剪碎至糊狀。對其進行原代培養，0.25%胰蛋白酶消化1 h，待細胞分散良好后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基終止消化，添加終濃度為0.87% NH4CI于37 ℃條件下作用5 min。100目細胞濾網過濾后，1 000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 pg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基重懸細胞并使其分散，在37 ℃、5%CO2培養箱培養。2 d更換1次細胞培養液，直至細胞形成單層，使用0.25%胰蛋白酶消化，鏡檢計數，調整細胞密度為1×106/mL重新接種，傳代培養。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖 取對數期垂體瘤細胞，以1×105/mL的細胞密度接種于96孔板，每孔200 μL。待細胞貼壁后吸去培養基，加入不含血清的RPMI1640培養液饑餓培養12h后，更換不同濃度10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、1 000 μg/mL芍藥苷的RPMI 1640培養液，陰性對照組加入不含芍藥苷培養液。每組設置3個復孔，孵育48 h。每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續孵育4 h后終止培養，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，微振蕩10 min。選擇波長490 nm在酶標儀上讀取各孔吸光度(A490 nm)值。實驗重復3次，計算腫瘤細胞存活率：腫瘤細胞存活率(%)=(實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值)×100%。選擇細胞存活率為50%對應的芍藥苷濃度作為后續實驗的處理濃度，設置對照組、芍藥苷組、JAK2/STAT3激動劑(Olanzapine)組和芍藥苷+激動劑組，按照上述MTT法測定垂體瘤細胞存活率，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期的垂體瘤細胞，以1×106/mL細胞密度接種于24孔板上。分別使用芍藥苷(200 μg/mL)、JAK2/STAT3激動劑Olanzapine(20 μmol/L)、芍藥苷(200 μg/mL)+JAK2/STAT3激動劑Olanzapine(20 μmol/L)處理垂體瘤細胞，對照組為不含血清的RPMI 1640培養液。48 h后收集細胞，以2 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5～10 min，使用預冷1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)4 ℃重懸細胞，2 000 r/min(離心半徑10 cm)離心5 min，洗滌細胞2次；加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞；先后加入5 μL的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)避光室溫孵育15min，采用流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

1.2.4 RT-qPCR檢測JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax mRNA表達水平 收集各組細胞，PBS清洗細胞2次，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，超微量分光光度計測定A260/280及其濃度。反轉錄體系：5×Mix 4 μL，RNA 1 μg，加DEPC-H2O至20 μL；反應程序：25 ℃ 10 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。逆轉錄產物稀釋到1 mL作為cDNA。按照PCR試劑盒配制反應體系后進行反應，反應參數：95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 45 s。其中，95 ℃預變性60 s；共循環40次[7]。待測基因qPCR引物使用Primer 3.0設計，序列見表1。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表達 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測樣品濃度。蛋白變性，上樣到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕式轉膜儀將其轉移到NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用JAK2(1∶500)、p-JAK2(1∶200)、STAT3(1∶500)、p-STAT3(1∶200)、Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，再用HRP標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，電化學發光(ECL)暗室中顯影，對感光膠片條帶進行分析，目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 芍藥苷對垂體瘤細胞的生長抑制作用 與陰性對照組比較，不同濃度芍藥苷作用于垂體瘤細胞48 h后，細胞生長受到抑制，隨著芍藥苷濃度升高細胞存活率下降。芍藥苷>20 μg/mL，垂體瘤細胞存活率下降；芍藥苷為40～1 000 μg/mL時，細胞存活率從85.35%降低至18.62%。芍藥苷為200 μg/mL時，細胞存活率為50%。因此，選擇200 μg/mL濃度芍藥苷進行實驗。詳見圖1。

圖1 不同濃度芍藥苷對垂體瘤細胞存活率的影響

2.2 各組垂體瘤細胞存活率比較 各組垂體瘤細胞存活率比較，差異有統計學意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷組垂體瘤細胞存活率降低，激動劑組垂體瘤細胞存活率升高(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組、芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞存活率升高(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞存活率降低(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表2 各組垂體瘤細胞存活率比較(±s，n=3) 單位：%

與對照組比較，＊P<0.05；與芍藥苷組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，△P<0.05。圖2 各組垂體瘤細胞存活率比較

2.3 各組垂體瘤細胞凋亡率比較 各組垂體瘤細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷細胞凋亡率升高，激動劑組垂體瘤細胞凋亡率降低(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組、芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞凋亡率降低(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組垂體瘤細胞凋亡率升高(P<0.05)。詳見表3、圖3。

表3 各組垂體瘤細胞凋亡率比較(±s，n=3) 單位：%

與對照組比較，＊P<0.05；與芍藥苷組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，△P<0.05。圖3 各組垂體瘤細胞凋亡情況(A為流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況；B為各組細胞凋亡率比較柱狀圖)

2.4 各組垂體瘤細胞JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA水平比較 各組垂體瘤細胞Bcl-2和Bax mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷組Bcl-2 mRNA相對表達量降低，Bax mRNA相對表達量升高，激動劑組Bcl-2 mRNA相對表達量升高，Bax mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組和芍藥苷+激動劑組Bcl-2 mRNA相對表達量升高，Bax mRNA相對表達量降低(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組Bcl-2 mRNA相對表達量降低，Bax mRNA相對表達量升高(P<0.05)。各組JAK2、STAT3 mRNA表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖4。

與對照組比較，＊P<0.05；與芍藥苷組比較，#P<0.05；與激動劑組比較，△P<0.05。圖4 各組垂體瘤細胞JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA水平比較柱狀圖

2.5 各組垂體瘤細胞JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達比較 各組垂體瘤細胞p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.001)。與對照組比較，芍藥苷組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加，激動劑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減少(P<0.05)；與芍藥苷組比較，激動劑組和芍藥苷+激動劑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減少(P<0.05)；與激動劑組比較，芍藥苷+激動劑組p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加(P<0.05)。各組JAK2、STAT3蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表5、圖5。

圖5 各組垂體瘤細胞JAK2/STAT3信號通路相關蛋白表達條帶圖(A為對照組；B為芍藥苷組；C為激動劑組；D為芍藥苷+激動劑組)

3 討 論

垂體瘤是常見的中樞神經系統腫瘤之一，流行病學研究表明，普通人群垂體瘤發病率為16.7%，目前的診治難題包括腫瘤復發及藥物抵抗等[8]。垂體瘤發病機制主要是異常的生理調節，由于靶腺負反饋調節的喪失或丘腦下部異常的正向調節，導致過度刺激增生，分化的、激素表達的垂體細胞譜系引起腺瘤發生，常伴有自發的激素超量分泌。不同的激素過量分泌取決于細胞起源。應答性下丘腦激素和旁分泌增殖信號導致垂體細胞周期失調，伴有非整倍性、染色體拷貝數變異和抑制惡性轉化的細胞性衰老，癌基因激活或抑癌基因喪失[9]。垂體瘤的治療以外科手術為主，由于腫瘤侵襲結構復雜，存在手術全切困難、全切率低，且有手術禁忌證、并發癥、術后復發等局限性。藥物作為重要的輔助治療手段，可減少激素的異常分泌，降低激素高分泌水平狀態，緩解內分泌癥狀，減小腫瘤體積甚至消除腫瘤，從而延緩腫瘤復發。

芍藥苷是一種蒎烷單萜糖苷，具有多種生物學效應且毒副作用小[10]。相關研究表明，芍藥苷具有抗癌活性，包括乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌、胃癌、神經膠質瘤等[11-15]。抗腫瘤的作用機制為抑制腫瘤細胞的增殖和新血管形成，誘導細胞凋亡及抑制腫瘤侵襲和轉移[6]。目前，芍藥苷治療垂體瘤的研究報道較少。本研究通過探討芍藥苷對垂體瘤細胞增殖凋亡的影響及作用機制，為芍藥苷相關藥物的研發及垂體瘤的臨床治療提供理論依據。結果顯示，不同濃度芍藥苷對垂體瘤細胞的增殖有抑制作用，細胞存活率呈濃度依賴性。流式細胞分析實驗結果表明芍藥苷可誘導垂體瘤細胞凋亡。

STAT3是一種細胞質轉錄因子，可調節細胞增殖、分化、凋亡和免疫反應等，參與啟動凋亡相關基因Bcl-2、Bax等表達[16]。細胞外配體與膜受體結合引起受體亞基多聚化，JAK2在受體的胞漿側募集，發生磷酸化，p-JAK2可使STAT3通過SH2區域發生同源二聚化，促使STAT3磷酸化，活化的STAT3借助于核轉運蛋白α轉移到細胞核，進而與特異性核酸序列結合，調節靶基因轉錄。相關研究顯示，50%以上的腫瘤包括實體腫瘤和血液學腫瘤(卵巢癌、前列腺癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等)的發生與STAT3信號通路激活有關[17-18]。Zheng等[14]研究表明，芍藥苷通過抑制STAT3信號通路，抑制人胃癌細胞增殖。Nie等[15]研究表明，芍藥苷通過抑制STAT3通路，降低下游與細胞增殖和抗凋亡相關基因Bcl-2表達，從而誘導神經膠質瘤細胞的生長抑制和凋亡。本研究取對數期垂體瘤細胞，經芍藥苷、STAT3通路激動劑及芍藥苷+激動劑處理后檢測JAK2、STAT3、Bcl-2和Bax mRNA、蛋白表達及p-JAK2、p-STAT3水平。結果顯示：芍藥苷可下調垂體瘤細胞p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2轉錄和表達，上調Bax轉錄和表達，抑制p-JAK2、p-STAT3激活，STAT3通路激動劑(Olanzapine)呈相反的作用效果，激動劑和芍藥苷處理后，激動劑對相關基因轉錄和蛋白表達的促進或抑制作用被逆轉，提示芍藥苷通過調控STAT3信號通路抑制垂體瘤細胞增殖，促進其凋亡。

綜上所述，芍藥苷可抑制垂體瘤細胞增殖，誘導凋亡，其機制可能是通過抑制STAT3信號通路相關分子mRNA和蛋白表達，調控細胞增殖凋亡相關基因的表達，發揮抗腫瘤作用。本研究為芍藥苷相關藥物的研發及其應用于垂體瘤的臨床治療提供實驗支持。