Leu(CAG)-tRNA碎片對肺腺癌的診斷、預后評估價值及其與臨床特征的關系

翁志華, 王 磊, 周 俊

(1. 江蘇省揚州市第二人民醫院 呼吸內科, 江蘇 揚州, 225002;2. 揚州大學附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科, 江蘇 揚州, 225009)

在全球人類的惡性腫瘤中，肺癌發病率居首位，且其復發率和病死率也位居癌癥前列[1]。肺腺癌(LAC)是肺癌常見的病理類型，屬非小細胞肺癌(NSCLC)范疇，其發病率和病死率逐年上升[2-3]。盡管醫學診療手段不斷進步，但肺癌的診斷和治療效果還有待提高，故尋找新的肺癌診斷和預后判定指標以及分子治療方案十分重要。小的非編碼RNA如微小RNA(miRNAs)、Piwi-相互作用RNA (piRNAs)、環狀RNA (circRNAs)和tRNA衍生的RNA碎片(tRFs)等與癌癥密切相關[4-6]。tRFs長度為14～35 nt, 其在特定環境中總是從tRNA的5′端或3′端派生碎小片段。目前, tRFs的生物學功能仍然未知，其已逐步成為腫瘤研究的熱點之一。Leu(CAG)-tRNA(tRF-LeuCAG)在NSCLC組織中表達水平高于癌旁正常組織，通過提高AURKA表達水平可加速細胞周期，促進細胞增殖，可以作為NSCLC分子標志物[7]。本研究探討了tRF-LeuCAG在68例LCA組織中的作用和影響，發現tRF-LeuCAG在LAC中有促進淋巴結轉移、診斷及評估預后的作用。

1 資料與方法

1.1 標本和資料收集

本研究的68對LAC組織和癌旁正常肺組織(距離癌灶周邊3 cm以上沒有腫瘤細胞的正常肺組織)為2018年1月—2019年4月揚州大學附屬醫院胸外科手術切除標本。患者年齡42～70歲，男40例，女28例。納入標準: ① 臨床、病理數據完整無缺失者; ② 經病理學檢查確診為LAC者; ③ 初治，術前未接受放化療、免疫治療等抗腫瘤治療者; ④ 患者知情同意，經揚州大學附屬醫院倫理委員會備案。排除標準: ① 伴有其他惡性腫瘤者; ② 有重要器官功能障礙者; ③ 依從性較差者。所有患者臨床病理特征包括年齡、性別、吸煙、腫瘤大小、病理分級、淋巴結轉移(NM)和臨床TNM分期[分期標準采用國際抗癌聯盟(UICC)第8版]。新鮮LAC組織采集后，除實驗使用外，剩余組織放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱內長期保存，以備后期實驗所用。

1.2 細胞和質粒

LAC細胞株A549、NCI-H1975和正常支氣管上皮細胞16HBE購自中科院上海生物細胞庫。細胞培養在含有10%胎牛血清(FBS, HyClone公司)、120 IU/mL青霉素和120 mg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，加濕培養箱的溫度為37 ℃, 內含5%二氧化碳。tRF-LeuCAG模擬物/抑制劑和陰性對照品(NC)均購自廣州RIBOBIO生物科技有限公司。

1.3 細胞轉染實驗

使用InvitrogenTMLipofectamine 3000 (Life Technologies, 美國)進行細胞轉染。根據實驗說明書，將200 nmol/L的tRF-LeuCAG實驗組和空白對照組的產品(RIBOBIO, 廣州)瞬時轉染至肺癌細胞中。轉染后24～48 h進行后續實驗處理，其中包括增殖和細胞周期分析。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

LAC標本和細胞總RNA分離使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)，得到的總RNA的光密度(OD)260 nm/OD230 nm值大于1.8。根據試劑盒說明書使用Takara公司的PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis試劑盒，將總RNA逆轉錄成cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒(Takara)的步驟操作說明，在Applied Biosystems 7500 PCR儀器上進行qRT-PCR。tRF-LeuCAG上游引物為GCCGAGCGGTCTAAGGCGC, 下游引物為通用引物。tRF-LeuCAG的相對定量是通過內參U6表達水平的標準化獲得。U6上游引物為AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG, 下游引物為CAGTGCAGGGTCCGAGGT。

1.5 RNA原位分子雜交(RISH)檢測tRF-LeuCAG的表達

68例LAC組織及癌旁正常組織石蠟包埋后，組織切片脫蠟至水。室溫下H2O2處理后，使用胃蛋白酶消化組織切片以便暴露核苷酸片段。滴加預雜交液放置培養箱中孵育組織切片，然后加入雜交液孵育12 h。清洗后加入密封液。加入生物素化地高辛。組織中加入鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)。加入生物素化過氧化物酶。組織進行DAB染色、蘇木精復染、洗滌、脫水、透明、封閉。用預雜交液代替含有探針的雜交液作為空白對照，探針序列為GTCAGGATGGCCGAGCGGTCTAAGGCGC。

1.6 Transwell實驗檢測tRF-LeuCAG對LAC細胞的遷移情況

各組肺癌細胞分別用無血清DMEM培養液制備成細胞懸液(約含1 × 105個細胞)。將0.2 mL細胞懸液吸取至Transwell小室的上室內，并將20%FBS的DMEM培養液0.6 mL吸至Transwell小室的下室內，置于有濕度的CO2培養箱內孵育24～48 h。小室取出后用棉簽擦掉沒穿膜的肺癌細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后添加95%乙醇固定20 min, 再用結晶紫染色。隨機選擇5個高倍視野，在光學顯微鏡下計數遷移細胞數目，分析肺癌細胞的遷移情況。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 tRF-LeuCAG在LAC中的表達及與臨床病理特征的關系

qRT-PCR實驗結果(圖1)表明, 68例LAC組織中tRF-LeuCAG的表達量為(6.76±1.39), 癌旁正常組織(NC)中的表達量為(3.52±1.02)，提示LAC組織中tRF-LeuCAG表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P=0.031)。在淋巴結(NM)轉移方面，淋巴結轉移組(NM+,n=29)tRF-LeuCAG表達量為(7.76±1.93), 高于無淋巴結轉移組(NM-,n=39)的(2.52±1.12), 差異有統計學意義(P=0.015)。tRF-LeuCAG的表達與LAC的分化程度和淋巴結轉移密切相關(P<0.05), 但與年齡、性別、吸煙、腫瘤直徑、腫瘤分級及TNM分期無相關性(P>0.05)。見表1。

與對應組織比較, *P<0.05。圖1 tRF-LeuCAG在不同組織中的表達量

表1 tRF-LeuCAG表達水平與LAC臨床病理特征的關系

2.2 tRF-LeuCAG在LAC中的陽性表達情況

采用RISH檢測68對LAC組織和癌旁肺組織中 tRF-LeuCAG的陽性表達情況。RISH結果表明，在LAC中RF-LeuCAG主要為陽性表達，陽性顆粒為棕黃(褐)色，大小不一、顏色深淺不一，分布在細胞質(漿)中，見圖2。在LAC組織中tRF-LeuCAG的陽性率為73.53%(50/68), 高于鄰近正常肺組織的13.24%(9/68), 差異有統計學意義(χ2=5.246,P=0.022), 見表2。本實驗結果再次驗證了tRF-LeuCAG在LAC中表達水平上調。

A、B: LAC組織中tRF-LeuCAG陽性表達圖; C: LAC組織中tRF-LeuCAG陰性表達圖; D、E: 癌旁正常肺組織中tRF-LeuCAG陰性表達圖; F: 癌旁正常肺組織中tRF-LeuCAG陽性表達圖。B、E放大倍數為400倍,其余放大倍數為200倍。圖2 tRF-LeuCAG在LAC組織和癌旁正常組織中的表達

表2 tRF-LeuCAG和CEA表達水平對肺腺癌的診斷價值

2.3 tRF-LeuCAG和癌胚抗原(CEA)表達水平對LAC的診斷價值

CEA是LAC常用的腫瘤檢測標志物，故本研究將CEA作為對比參數。ROC曲線結果顯示，在LAC組織中tRF-LeuCAG和CEA診斷效能指標見表2、圖3, 提示tRF-LeuCAG和CEA在LAC組織中診斷效能幾乎一致，推測tRF-LeuCAG未來可能成為新的LAC檢測生物分子標志物。

圖3 tRF-LeuCAG和CEA水平診斷LAC的ROC曲線

2.4 tRF-LeuCAG與LAC患者生存預后的關系

根據qRT-PCR結果, 68例LAC組織中tRF-LeuCAG表達水平(大于其在癌旁正常組織的表達水平)升高的病例有53例(升高組)，其余表達水平正常或下降的病例有15例(正常和下降組)。升高組的3年中位總生存時間(OS)為14個月(四分位區間為 6～28個月)，正常和下降組中位OS為22個月(四分位區間為11～36個月)。升高組OS短于正常和下降組，差異有統計學意義(χ2=13.72,P=0.002;HR=2.968, 95%CI為1.669～5.277), 見圖4。

圖4 tRF-LeuCAG表達水平與患者3年預后的生存曲線圖

2.5 tRF-LeuCAG促進肺癌細胞遷移

上述研究表明tRF-LeuCAG與患者的淋巴結轉移密切相關，因此通過Transwell遷移實驗進一步研究tRF-LeuCAG對肺癌轉移的影響。首先通過qRT-PCR驗證過表達tRF-LeuCAG(過表達組)和降低tRF-LeuCAG表達(降低表達組)的有效性(圖5A、5B)。Transwell遷移實驗結果顯示(圖5C、5D), 過表達tRF-LeuCAG促進了肺癌細胞A549和NCI-H1975的遷移，而降低tRF-LeuCAG表達則阻礙了遷移(P<0.05), 提示tRF-LeuCAG能促進肺癌細胞遷移，進而向遠處器官轉移。

A、B: qRT-PCR證實tRF-LeuCAG在A549和NCI-H1975細胞中過度表達或降低表達有效; C、D: Transwell實驗檢測A549和H1650細胞的遷移情況。與對照組比較, *P<0.05。圖5 tRF-LeuCAG促進肺癌細胞遷移(放大倍數400倍)

3 討 論

目前，肺癌發病率居各類腫瘤首位，也是癌癥死亡的常見類型[8-9]。肺癌患者死亡的原因主要為肺癌的轉移、復發和耐藥性[10], 因此尋找肺癌診斷、治療和預后評估的分子標志物變得越來越迫切。

轉運RNA (tRNAs)是一種經典的非編碼RNA，能將信使RNA (mRNA)上的遺傳信息轉化為氨基酸序列信息，從而合成蛋白質。在內分泌失調、缺氧等應激條件作用下，tRNA裂解出許多碎片，包括tiRNAs和tRFs。研究[11-13]表明tRNA片段可作為信號分子和基因表達的調控因子，在腫瘤、代謝性疾病和神經系統疾病等重大疾病中具有重要的調控作用。在肺癌研究中，無論是在患者血漿還是在肺癌組織中，正常人和LAC患者的tRNA片段分布都存在顯著差異，其中tRF-16-L85J3KE、tRF-21-RK9P4P9L0和tRF-16-PSQP4PE參與了許多癌癥的信號途徑，能作為新的診斷生物標志物和治療的靶點[14]。一項研究[15]通過基因測序驗證了3個tRF(tRF-Ser-TGA-010、tRF-Arg-CCT-018和tRF-Val-CAC-017)在LAC組織中呈低表達水平，這些下調的tRF-1可能參與LAC的發病機制，并可能作為潛在的生物診斷標志物，或協調藥物開發的靶基因。研究[7]發現, tRF-LeuCAG表達水平升高并在NSCLC中得到了驗證; 在肺癌細胞H1299功能研究中得出抑制tRF-LeuCAG的表達則能抑制細胞增殖并阻礙細胞周期; tRF-LeuCAG可能參與調節NSCLC的發生并可能成為NSCLC潛在的治療靶點。然而，關于tRF-LeuCAG調控LAC細胞遷移和轉移的影響和作用，以及其能否作為診斷和預后評估的指標的研究較少。

本研究通過qRT-PCR和RISH檢測發現，tRF-LeuCAG在LAC組織中表達水平顯著上調并與淋巴結轉移密切相關，即tRF-LeuCAG表達水平越高，LAC的分化程度越低，且患者淋巴結轉移的可能性就越大。過表達tRF-LeuCAG促進肺癌細胞的遷移，降低tRF-LeuCAG表達則抑制了細胞的遷移。這些結果表明在LAC的發生發展過程中, tRF-LeuCAG可能起到促癌基因和促遷移、轉移的作用。ROC曲線分析表明, tRF-LeuCAG和CEA的診斷效能基本一致，推測tRF-LeuCAG也可能在不久的將來作為LAC診斷的一種新的分子標志物。本研究與相關研究[4, 13]均證實tRNA碎片可能會成為腫瘤的診斷指標。本研究結果表明, tRF-LeuCAG升高組的3年OS為14個月，而正常和下降組中位OS為22個月，升高組OS顯著短于正常和下降組。這一結果再次證實了檢測tRF-LeuCAG表達對提高LAC治療效果和預后評估有重要的臨床意義。此外, tRF-LeuCAG表達也與腫瘤的分化相關，而分化也反映了腫瘤的惡性程度和預后: 分化越低的腫瘤組織越會出現tRF-LeuCAG高表達，因而LAC惡性程度高，患者預后差、生存時間較短; 高表達的tRF-LeuCAG預示著腫瘤細胞容易有淋巴結轉移，同樣患者預后較差，與相關研究[7, 14]結果相一致。上述結果表明tRF-LeuCAG可作為LAC患者預后評估的一個的強有力的生物學指標。但本研究存在一定局限性，僅研究了tRF-LeuCAG對診斷和預后的影響以及對腫瘤細胞遷移的作用，沒有研究tRF-LeuCAG對轉移作用的具體調控機制，這將會在今后的實驗中繼續探討。

綜上所述，檢測tRF-LeuCAG在LAC組織中的表達具有臨床病理意義，該指標未來可能成為LAC患者診斷、生存期評估的新型標志物。本研究為尋找LAC個性化治療和診斷、預后評估指標提供了有臨床價值的理論依據。