長鏈非編碼RNA HAGLROS在胃癌中的生物信息學分析

吳 鵬, 馮 鋒, 胡道卿, 江家星, 王志寧

(南京明基醫院/南京醫科大學附屬明基醫院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

2020年全球癌癥統計數據顯示，胃癌的發病率和病死率在全球范圍內分別排第5位和第4位[1]。中國是胃癌高發國家，2020年胃癌的發病率和病死率均居惡性腫瘤的第3位[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類大小在200核苷酸以上、缺少開放閱讀框、無蛋白質編碼功能的RNA。研究[3]發現, LncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達，可參與腫瘤的增殖、侵襲轉移、代謝、免疫、耐藥等過程。一些LncRNA被證實在胃癌的發生發展、侵襲轉移等過程中起著重要的作用，可作為胃癌診斷和預后的潛在標志物及治療靶點[4]。本課題組前期研究發現LncRNA HAGLROS在胃癌中高表達，能通過激活mTOR通路和抑制自噬促進胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移。研究[5]發現, HAGLROS不僅能通過競爭性地吸附微小RNA-100-5p(miR-100-5p)使mTOR表達上調，而且能通過綁定mTORC1復合物激活mTORC1信號轉導通路抑制自噬，從而維持胃癌細胞的惡性表型。

近年來研究[6]證實HAGLROS可參與胃癌、肝癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的惡性發展過程。WEI H M等[7]發現, HAGLROS能通過調控miR-5095/ATG12軸和PI3K/AKT/mTOR信號促進肝癌細胞的增殖，抑制凋亡及增強自噬。因此, HAGLROS在腫瘤的診斷、治療中有廣闊的應用前景，但目前的研究仍不夠深入，文獻檢索HAGLROS在腫瘤中的研究目前僅有24篇，在胃癌中的研究極少，有待進一步的挖掘和探索。本研究采用生物信息學的方法結合公共數據庫研究HAGLROS在胃癌中的潛在功能和機制，為基礎實驗及臨床研究提供一定的理論依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 應用公共數據庫分析HAGLROS在胃腺癌中的表達

應用UCSC Xena數據庫(https://xenabrowser.net/)分析LncRNA HAGLROS在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達水平。采用四分位數法將HAGLROS分為高表達組(>75%)和低表達組(<25%), 采用Log-rank檢驗和Kaplan-Meier檢驗對HAGLROS進行生存分析,P<0.05為差異有統計學意義。

1.2 應用腫瘤與癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫分析HAGLROS的共表達基因

從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載胃癌基因表達譜。采用R語言分析HAGLROS的共表達基因(選取的是蛋白質編碼基因)，篩選標準為Pearson相關系數絕對值>0.3且P<0.01。采用R軟件的clusterProfiler包對共表達基因進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析并繪圖,P<0.05表示富集結果顯著。應用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)和WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)在線數據庫對共表達基因進行功能富集分析。

1.3 HAGLROS共表達基因的網絡互作分析及關鍵基因的篩選

應用STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)進行HAGLROS共表達基因的蛋白質互作(PPI)網絡分析，再導入Cytoscape軟件中進行PPI網絡可視化處理，然后使用cytoHubba插件對PPI網絡中的基因進行節點得分計算，并依據排名篩選關鍵基因。運用UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/)分析目的基因在胃腺癌及正常胃黏膜組織中的表達情況以篩選差異表達(P<0.01)的基因。

1.4 預測與HAGLROS相互作用的微小核糖核酸(miRNA)

應用miRDB(http://mirdb.org/)、LncBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.phpr=lncbasev2%2Findex)、RNAhybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)這3個在線數據庫預測可能與HAGLROS結合的miRNA, 并取交集。利用UALCAN在線數據庫分析各miRNA在胃腺癌中的表達水平。

1.5 預測miRNA的下游靶基因

運用R軟件在miRDB、miRTarBase、TargetScan這3個數據庫中對預測及篩選得到的miRNA進行下游靶基因的預測，并取交集，選擇3個數據庫均能預測得到的靶基因進行下一步的研究。采用Cytoscape軟件對內源競爭RNA(ceRNA)關系進行繪圖。

1.6 miRNA下游靶基因的功能富集分析

采用Metascap(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)在線數據庫對miRNA的下游靶基因進行功能富集分析。

1.7 對miRNA下游靶基因和共表達基因取交集

將1.5步驟中預測得到的miRNA下游靶基因與1.2步驟中得到的HAGLROS共表達基因取交集，并建立LncRNA-miRNA-mRNA軸。

2 結 果

2.1 HAGLROS 在胃腺癌中的表達水平及生存分析

通過UCSC Xena數據庫分析發現, HAGLROS在胃腺癌中的表達水平高于正常胃黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.001)。對HAGLROS進行的生存預后分析結果顯示，隨著HAGLROS表達量的升高，胃癌患者的總生存期(OS)下降，差異有統計學意義(P<0.001), 見圖1。

2.2 HAGLROS的共表達基因及其GO分析和KEGG通路分析

采用R語言分析HAGLROS的共表達基因(選取的是蛋白質編碼基因)，共獲得301個。采用R語言對這301個基因進行KEGG通路富集分析發現，其主要與乳腺癌、黑色素瘤、Rap1信號通路、Wnt信號通路、干細胞多能性調控信號通路、鞘脂類信號通路、肌動蛋白細胞骨架調節、胃癌、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等相關，見圖2。采用Metascape數據庫進一步行共表達基因的功能富集分析，發現其主要參與胚胎和器官的生長發育、神經和突觸生長、細胞組分形態發生等生物學過程以及Wnt信號通路、神經系統等相關通路，見圖3。為進一步分析HAGLROS共表達基因的生物學過程，采用WebGestalt數據庫進行GO富集分析，發現其主要與神經前體細胞增殖、感覺器官形態發生、突觸囊泡循環及介導的轉運、中樞神經系統神經元分化、Notch信號通路、胚胎器官發育、跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶信號轉導、突觸前等有關，與Metascape數據庫分析結果基本一致，見圖4。

圖2 HAGLROS共表達基因的KEGG富集分析

圖3 HAGLROS共表達基因的功能富集分析(Metascape)

圖4 HAGLROS共表達基因的GO分析(WebGestalt)

2.3 HAGLROS共表達基因的網絡互作分析及其關鍵基因的篩選

采用STRING數據庫構建HAGLROS共表達基因的PPI網絡，將置信度設置為大于0.4, 得出由300個蛋白節點和294對互作關系組成的網絡。將數據導入Cytoscape軟件中構建PPI網絡圖，利用cytoHubba插件進行拓撲結構分析，共有12種方法，其中Degree和MCC是最常用的方法，將2種方法排名前30位的基因取交集，得出23個基因，輸入STRING數據庫中，見圖5。通過蛋白注釋發現，大多數基因與胚胎生長發育及神經生長相關，其中FGF8、FGF3、FGF17、FGF19、SALL4、GBX2、TBX2、SNAI1可參與胚胎生長發育;NES、FGF8、FGF3、FGF17、FGF19、ZIC1、SYN1、SYN2、DLX1、DLX2、DLX5、TUBB3、CAMK2B、PCLO、GBX2、DRD2、SALL4可參與神經發育生長、軸突突觸形成或神經遞質的釋放與傳遞。

圖5 23個關鍵基因的網絡圖

為進一步縮小關鍵基因范圍，本研究將Degree和MCC排名前10位的基因取交集，得到FGF8、NES、FGF3、SYN1、SYN2、DLX1、DLX2、DLX5。在UALCAN數據庫中分析這8個基因在胃腺癌中的表達情況，發現NES、FGF8、FGF3在胃腺癌中表達高于正常胃黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.001), 見圖6, 而且他們在cytoHubba插件的12種算法中的得分排名基本也是最靠前的。共表達分析結果顯示,NES、FGF8、FGF3在胃癌中與HAGLROS的Pearson相關系數分別為0.37、0.447、0.354, 見圖7。由此可見,NES、FGF8、FGF3可能與HAGLROS的關系最為密切，并以一定的方式與 HAGLROS聯系并通過調控相關通路促進胃癌的發生、發展。

A: NES基因的表達情況; B: "FGF8基因的表達情況; C: FGF3基因的表達情況。圖6 關鍵基因在胃癌及正常組織中的表達

A: NES基因與HAGLROS的共表達情況(相關系數=0.37, P=1.222e-14); B: FGF8基因與HAGLROS的共表達情況(相關系數=0.447, P=2.078e-21); C: FGF3基因與HAGLROS的共表達情況(相關系數=0.354, P=1.959e-13)。圖7 關鍵基因與HAGLROS的共表達關系

2.4 分析HAGLROS結合的miRNA并預測miRNA下游靶基因

應用miRDB、LncBase、RNAhybrid這3個數據庫預測能與HAGLROS結合的miRNA，并取交集，得出3個數據庫均能預測出的miRNA共16個: hsa-miR-1297、hsa-miR-4750-3p、hsa-miR-6749-3p、hsa-miR-548f-5p、hsa-miR-1976、hsa-miR-548g-5p、hsa-miR-548aj-5p、hsa-miR-548x-5p、hsa-miR-6727-3p、hsa-miR-5197-5p、hsa-miR-5691、hsa-miR-4257、hsa-miR-6776-5p、hsa-miR-6805-3p、hsa-miR-6892-3p、hsa-miR-548aw。通過UALCAN數據庫分析上述16個miRNA在胃腺癌中的表達情況，發現其中4個miRNA在胃腺癌中表達，即hsa-miR-1976、hsa-miR-6805、hsa-miR-6892、hsa-miR-548aw。應用miRDB、miRTarBase、TargetScan這3個數據庫預測這4個miRNA的靶基因，并取交集，發現共有124個靶基因可以通過這3個數據庫同時預測得出，其中hsa-miR-1976的靶基因有27個, hsa-miR-6892-3p有11個, hsa-miR-548aw有86個。hsa-miR-6805-3p的靶基因在這3個數據庫中未取得交集。采用Cytoscape軟件繪制ceRNA網絡圖，見圖8。

圖8 ceRNA網絡構建

2.5 miRNA下游靶基因的功能富集分析

利用Metascape在線數據庫對上述得到的miRNA的124個靶基因進行功能富集分析，發現主要與Kaiso-NCOR蛋白復合物、神經前體細胞增殖、脂質生物合成過程的正向調控、肌動蛋白纖維組織、蛋白質分解代謝過程、管形態發生、神經系統發育調節、磷脂生物合成過程、細胞分化的負調控等生物學過程及SMAD2/3和SMAD4轉錄活性下調、Wnt信號通路與多能性、mTOR信號通路、Fcγ受體介導的吞噬作用、冠狀病毒感染中的內質網應激反應、T17細胞分化、甲狀腺激素信號通路等信號通路有關。見圖9。

圖9 miRNA下游靶基因的功能富集分析(Metascape)

2.6 miRNA下游靶基因與HAGLROS共表達基因取交集

采用R軟件將124個靶基因與HAGLROS的301個共表達基因取交集，繪制韋恩圖，得出1個基因ORAI2,ORAI2是上述預測得到的3個miRNA中miR-1976的靶基因，見圖10。運用GEPIA數據庫對ORAI2進行分析，發現ORAI2在胃腺癌中高表達，差異有統計學意義(P<0.01); 在共表達關系中, HAGLROS與ORAI2的Pearson相關系數為0.321, 見圖11。通過查閱文獻，發現ORAI2基因編碼的蛋白質是細胞膜上鈣通道ORAI蛋白的一個亞基，在鈣離子內流過程中發揮重要的作用，而鈣離子通道的功能異常與腫瘤的增殖、侵襲、轉移、血管生成、免疫抑制、耐藥等過程密切相關[8]。由此推斷, HAGLROS-miR-1976-ORAI2軸可能參與調控胃癌的發生發展過程，需要后續實驗的進一步論證。

圖10 miRNA下游靶基因與HAGLROS共表達基因取交集

A: ORAI2在胃癌中高表達; B: ORAI2與HAGLROS的共表達關系。圖11 ORAI2在胃癌中高表達及與HAGLROS的共表達關系

3 討 論

本研究發現HAGLROS在胃腺癌中的表達較正常胃黏膜組織顯著升高，生存分析顯示HAGLROS低表達患者的OS較高表達患者顯著延長。在下載胃腺癌的TCGA數據庫后，利用R語言分析得出HAGLROS的共表達基因共301個; KEGG通路分析發現，共表達基因主要涉及Rap1、Wnt、干細胞多能性調控、MAPK、PI3K-Akt等信號通路及胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等癌癥; 進一步采用Metascape、WebGestalt數據庫分析發現，共表達基因主要參與胚胎和器官的生長發育、神經和突觸生長等生物學過程以及Wnt、Notch等相關通路; 對共表達基因進行PPI分析及關鍵基因篩選，發現關鍵基因與胚胎生長發育及神經生長密切相關，并得出與HAGLROS關系最為密切的3個基因，即NES、FGF8、FGF3。綜合上述結果，本研究推斷HAGLROS在胃癌中可能與胚胎和器官的生長發育、神經和突觸生長等生物學過程以及Wnt、Notch、干細胞多能性調控等通路相關，而NES、FGF8、FGF3可能是HAGLROS調控胃癌發生發展過程中的最關鍵的3個基因，并需要進一步的基礎研究和實驗論證。

本研究分析得出HAGLROS在胃癌中可能與胚胎和器官的生長發育有關。早期研究[9]顯示，腫瘤的生物學行為與早期胚胎發育存在相似性，包括腫瘤的侵襲性與胚胎植入、兩者的基因和蛋白質水平以及免疫逃避途徑等方面。腫瘤細胞在胚胎微環境中可失去惡性表型而參與正常組織分化，而胚胎離開其發育的微環境則可產生惡性腫瘤[10]。鐘艷平等[11]提出了腫瘤發生的“二元論”，一個途徑為正常胚胎和個體發育過程中因分化受阻而產生相應的分化型腫瘤，另一個途徑為成熟體細胞在壓力因素下通過啟動“逆向分化”形成多倍體腫瘤巨細胞(PGCCs)而獲得多能干性，啟動內周期和內分裂，這一階段類似于胚胎發育最早期的卵裂階段，但因未經歷正常有性生殖過程中種植的程序，最終產生各種高核級腫瘤。

本研究還得出一個重要的結論，即HAGLROS可能與胃癌中神經生長有關。既往研究[12]認為腫瘤中存在周圍神經浸潤，即腫瘤細胞在現有神經周圍的生長和浸潤。近年來研究發現，腫瘤中還存在新生的神經和軸突[13]。2017年, MAUFFREY P等[14]研究發現，小鼠腦室下區的神經祖細胞可透過血腦屏障遷移至腫瘤和轉移灶，分化為腎上腺素能神經，而腫瘤干細胞推動了神經的再生。2020年, AMIT M等[15]研究發現，p53敲除或突變的口腔鱗狀細胞癌細胞外囊泡內miR-34a水平的降低促進了腫瘤內感覺神經的生成，并誘導這些神經分化為腎上腺素能神經。腫瘤還可分泌神經營養因子、軸突導向分子及細胞外囊泡而誘導神經軸突的發生。研究[13]表明，腫瘤中新生神經可能受交感和副交感神經的支配調節以促進腫瘤內新生血管的形成、腫瘤細胞的化療耐藥及免疫逃逸等，進而促進腫瘤的生長。研究[15]發現miRNA可參與腫瘤內新生神經的生長，但LncRNA還需要進一步的挖掘和研究。本研究發現Wnt信號通路可能是HAGLROS促進胃癌發生發展的重要通路。Wnt信號通路在胚胎器官發育、神經系統發育、干細胞的更新分化等過程中起關鍵的作用[16]。另外, Notch、干細胞多能性調控信號通路也在胚胎發育、干細胞分化過程中起著重要的作用。

NES、FGF3、FGF8是本研究分析得出的與HAGLROS關系最密切的3個基因。NES又稱Nestin, 是一種細胞骨架相關的Ⅵ類中間絲蛋白，是神經干細胞的特征性標志物[17]。NES與腫瘤增殖、侵襲轉移和預后較差有關，且特異性地表達于腫瘤新生血管中[18]。FGF3、FGF8是成纖維細胞生長因子(FGF)家族的成員, FGFs通過結合其受體FGFRs, 激活下游多種信號通路，在胚胎發育、血管生成及腫瘤的上皮間質轉化(EMT)、復發、耐藥等過程中起著重要的作用[19]。研究[20]表明, FGF8、FGF3在前腦神經嵴、中腦后腦屏障等表達, FGF8在胚胎神經干細胞的分化和發育、神經活動過程中發揮重要的作用。此外，上述23個關鍵基因中, SALL4也是一種腫瘤干細胞基因，在維持胚胎早期發育、器官形成、胚胎干細胞自我更新和多能性方面起著重要的作用[21]。綜合上述分析，本研究推斷HAGLROS在胃癌中可能與胚胎器官生長發育、神經生長等生物學過程有關，而這些過程可能由腫瘤干細胞基因、神經干細胞基因等介導，進而通過調控Wnt、Notch、干細胞多能性調控等信號通路，影響胃癌的發生發展。

本研究采用生物信息學的方法預測與HAGLROS相結合的miRNA及其下游靶基因，并對靶基因進行功能富集分析，發現參與的生物學過程包括神經生長發育、細胞分化，相關通路包括Wnt信號通路與多能性、mTOR信號通路，這與HAGLROS共表達基因的富集分析中神經生長生物學過程及Wnt、干細胞多能性調控通路有一定的重合。為增加下游靶基因的準確性，本研究將其與HAGLROS的共表達基因取交集，得到ORAI2, 構成了HAGLROS-miR-1976-ORAI2軸。ORAI2是ORAI家族的一個亞型, ORAI蛋白位于細胞膜，與內質網膜上的基質反應蛋白(STIM)形成鈣釋放激活鈣通道(CRAC), 促進鈣池操縱性鈣內流(SOCE), 調節細胞內鈣的穩態[22]。研究[23]發現, ORAI的異常表達可導致鈣內流的失調，參與腫瘤的增殖、侵襲轉移等過程。WU S Y等[24]研究發現, ORAI2在胃癌及轉移淋巴結中高表達，與腫瘤的低分化、侵襲、淋巴結轉移和較差的預后有關，其能通過PI3K/Akt信號通路和MAPK依賴的黏著斑解離途徑促進胃癌細胞的增殖和轉移。

綜上所述，本研究運用生物信息學的方法預測并篩選HAGLROS在胃癌中的關鍵靶基因，分析HAGLROS參與胃癌的生物學過程及調控通路，并建立HAGLROS-miRNA-mRNA網絡，為HAGLROS在胃癌中的進一步研究提供新的思路和方向。