滸苔多糖對小鼠肝腎綜合征防治作用的研究

趙曉娟，王珊珊，周佳燕，何越，周雅婷，楊秋茜

(鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224007)

肝腎綜合征常發(fā)生在嚴重肝病后期，是一組繼發(fā)于有效血容量下降、內(nèi)源性血管活性物質(zhì)失衡、腎血流量下降、以腎功能損傷為主要表現(xiàn)的臨床綜合征[1]。肝腎綜合征具有病情復(fù)雜、病死率高和預(yù)后差的特點[2]。目前臨床治療肝腎綜合征以藥物治療、腎臟替代治療、分子吸附再循環(huán)等作為肝移植前過渡手段，而肝移植作為唯一的最終治療方案[1]。但是器官來源不足嚴重制約肝移植的臨床應(yīng)用。因此，積極尋找安全有效的替代方案對防治肝腎綜合征具有重要的臨床意義。

由于毗鄰黃海，鹽城有著得天獨厚的黃海和灘涂資料，為探尋防治肝腎綜合征新型藥物提供了豐富的來源。天然海藻中含有豐富的硫酸多糖，由于其生物活性廣泛且安全性高，已然成為當今海洋多糖類藥物研究的熱點[3]。滸苔(Enteromorphaprolifera)為大型綠藻，屬于石莼科滸苔屬。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，滸苔多糖的抗氧化、抗炎、抗脂質(zhì)蓄積的作用可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥性肝損傷[4]或非酒精性脂肪肝[4-5]，減輕環(huán)境污染誘發(fā)的肝毒性[6]；滸苔水提取物能明顯減輕糖尿病模型小鼠腎臟組織損傷[7]。可見，滸苔多糖具有良好的肝腎保護活性。但是，滸苔多糖能否有效改善肝腎綜合征發(fā)病時的嚴重肝損傷及腎功能不全尚待研究。因此，本研究建立四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝腎綜合征模型[8]，研究滸苔多糖對小鼠肝腎綜合征的保護作用，為其在緩解肝腎綜合征的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 滸苔干粉購自青島海大生物集團有限公司。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)、總抗氧化能力(T-AOC)、羥脯氨酸、肌酐(Cr)、尿素(UA)和尿素氮(UN)試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海科信儀器有限公司，型號：ZFY-2L)；酶標儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號：BIOBASE-EL10A)；真空冷凍干燥機(上海舜制儀器制造有限公司，型號：FD-2B-80)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，型號：KH-250B)；分光光度計(北京瑞利分析儀器公司，型號：1800)；臺式離心機(Sigma公司，型號：3K15)。

1.3 方法

1.3.1 滸苔多糖提取 稱取10 g滸苔干粉，加入800 mL超純水，90 ℃超聲1 h后再經(jīng)90 ℃恒溫水浴4 h。抽濾，取上清液濃縮至80 mL。加入240 mL無水乙醇，4 ℃靜置過夜。5 000 rpm離心15 min，收集沉淀溶解于50 mL超純水，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入50.0 mL Sevage去蛋白質(zhì)試劑，劇烈振搖15 min，靜置30 min，棄去有機溶劑層和蛋白質(zhì)層，再加入50.0 mL Sevage試劑。重復(fù)以上操作，直至沒有白色的蛋白質(zhì)層為止。在去蛋白后的溶液中加入150 mL無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，流水透析24 h，真空干燥得滸苔多糖。

1.3.2 滸苔多糖中糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定提取的滸苔多糖中糖含量。配制0.1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液和5%苯酚溶液備用。取6支試管依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的葡萄糖標準溶液，用超純水補齊到1 mL。然后向所有試管中加入5%苯酚溶液0.5 mL，再緩慢加入濃硫酸2.5 mL，混勻。靜置20 min后，在485 nm處測定OD485。以O(shè)D485為縱坐標，葡萄糖溶液濃度為橫坐標，繪制葡萄糖溶液標準曲線。精確配制0.1 mg·mL-1的滸苔多糖溶液，準確吸取0.3 mL于試管中，超純水補齊到1 mL。按上述苯酚-硫酸法測定滸苔多糖溶液OD485，代入標準曲線，即可求得溶液中糖含量。

1.3.3 肝腎綜合征模型建立及藥物干預(yù) 雌性昆明小鼠(20～22 g)，購自南通大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2019-0001。實驗動物飼養(yǎng)于江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院動物房，使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0008，室溫22～24 ℃，相對濕度50%～60%，每天12 h/12 h明暗交替(9∶00至21∶00開燈)。動物自由攝取實驗動物飼料與飲用水，適應(yīng)1周后進行如下實驗。

動物隨機分為空白對照組(10只)和模型組(40只)。所有動物在試驗期間均自由攝取飼料和飲用水。空白對照組動物腹腔注射生理鹽水，模型組動物腹腔注射四氯化碳(V四氯化碳∶V橄欖油= 1∶10)，1周2次，連給8周。造模4周后，將模型組動物再隨機分為模型對照組、滸苔多糖低(150 mg·kg-1)、中(300 mg·kg-1)和高(450 mg·kg-1)劑量組。每組10只小鼠。正常對照組和模型對照組動物每天腹腔注射生理鹽水，滸苔多糖低、中和高劑量組每天腹腔注射滸苔多糖溶液；從第5周至第8周，每天下午2∶30～3∶30給藥。

1.3.4 生物樣本收集 最后一次給藥后1 h，以60 mg·kg-1劑量腹腔注射水合氯醛溶液，待小鼠麻醉后實施心臟采血，然后打開小鼠腹腔，取出肝臟和腎臟并稱重。切取1 cm3左右組織固定于4%多聚甲醛，用于病理學(xué)檢測；其余組織在液氮中速凍。收集的血液在4 ℃中靜置過夜，經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，收集血清。血清、肝臟及腎臟組織保存于-80 ℃超低溫冰箱以備用。

1.3.5 血清生化指標檢測 取出保存于-80 ℃的血清樣品，待解凍后，分別采用AST、ALT、TG、TC、LDL-c、T-AOC、Cr、UA和UN標準診斷試劑盒，檢測血清中AST與ALT活性，測定血清TG、TC、LDL-c、T-AOC、Cr、UA和UN水平。

1.3.6 肝臟組織羥脯氨酸含量檢測 取出保存于-80 ℃的肝臟組織樣品，冰浴解凍后，每個樣品稱取100 mg左右，記錄組織濕重。將肝臟組織置于10 mL離心管，加入水解液徹底水解組織后，按照說明書檢測組織中羥脯氨酸含量，用組織濕重校正結(jié)果。

1.3.7 病理學(xué)檢測 肝臟和腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，以梯度濃度酒精依次脫水，石蠟包埋，切成5 μm薄蠟片，用蘇木素-伊紅和天狼星紅染色，在20倍光鏡下觀察肝臟和腎臟組織病理變化并拍照分析。

1.3.8 統(tǒng)計分析 結(jié)果用Mean±sem表示。數(shù)據(jù)選用One-way ANOVA結(jié)合Dunnett′s posthoc test進行組間差異分析。以P<0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著。用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 滸苔多糖中糖含量測定 如圖1所示，曲線在0～0.1 mg·mL-1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于滸苔多糖中糖含量的測定。經(jīng)測定，0.03 mg·mL-1滸苔多糖溶液OD485為0.475，將其代入標準曲線求得滸苔多糖溶液中糖濃度為0.029 007 mg·mL-1，因此滸苔多糖中糖含量為96.69%。

圖1 葡萄糖溶液標準曲線

2.2 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清脂質(zhì)水平的影響 如表1所示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清TG水平?jīng)]有顯著變化(P>0.05)，而TC(P<0.01)和LDL-c(P<0.05)水平顯著增加。與模型對照組相比，滸苔多糖低、中(150和300 mg·kg-1，P<0.001)和高劑量(450 mg·kg-1，P<0.01)組血清TC水平明顯降低；同時滸苔多糖3個劑量組血清LDL-c均顯著降低(150、300和450 mg·kg-1，P<0.05)；但是滸苔多糖對小鼠血清TG水平?jīng)]有明顯影響。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能逆轉(zhuǎn)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血脂紊亂。

表1 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清TG、TC和LDL-c水平的影響(n=6～7)

2.3 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠總抗氧化能力的影響 如表2所示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清T-AOC水平顯著降低(P<0.001)；與模型對照組相比，滸苔多糖高劑量組(450 mg·kg-1，P<0.05)血清T-AOC水平明顯升高。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能提高被四氯化碳抑制的小鼠抗氧化能力。

表2 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清T-AOC水平的影響(n=6～7)

2.4 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝功能影響 如表3所示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清ALT(P<0.001)和AST(P<0.001)活性均顯著升高。與模型對照組比較，滸苔多糖低、中、高劑量組小鼠血清ALT(150、300和450 mg·kg-1，P<0.001)和AST(150、300 和450 mg·kg-1，P<0.001)活性均顯著降低。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝功能失調(diào)。

表3 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清ALT和AST活性影響(n=6～7)組別

2.5 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝臟羥脯氨酸水平的影響 如表4所示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠肝臟組織內(nèi)羥脯氨酸含量顯著升高(P<0.001)。與模型對照組比較，滸苔多糖中劑量組小鼠肝臟羥脯氨酸水平顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能減輕四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化。

表4 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝臟羥脯氨酸水平影響(n=6～7)

2.6 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎功能的影響 如表5所示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清Cr(P<0.05)、UA(P<0.001)和UN(P<0.01)水平均顯著升高。與模型對照組比較，滸苔多糖組小鼠血清Cr(150和450 mg·kg-1，P<0.05；300 mg·kg-1，P<0.01)、UA(150 mg·kg-1，P<0.01；300 mg·kg-1，P<0.05；450 mg·kg-1，P<0.001)和UN(150、300和450 mg·kg-1，P<0.001)水平均顯著降低。以上結(jié)果表明，滸苔多糖能緩解四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎功能失調(diào)。

表5 滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠血清Cr、UA和UN水平的影響(n=6～7)

2.7 滸苔多糖對模型小鼠肝臟和腎臟組織病理變化的影響 如圖2所示，與空白對照組比較，模型對照組小鼠肝細胞淡染水腫，細胞內(nèi)有大量脂肪空泡，結(jié)構(gòu)排列紊亂，匯管區(qū)及點狀細胞壞死區(qū)域周圍可見大量炎性細胞浸潤，中央靜脈管腔明顯擴大，有大量膠原蛋白沉積，局部形成假小葉結(jié)構(gòu)；腎小管上皮細胞淡染水腫，部分腎小管管腔擴張，局部出現(xiàn)小管萎縮。與模型對照組相比，滸苔多糖組小鼠肝細胞脂肪空泡逐漸減少，水腫減輕，排列漸趨規(guī)則，壞死細胞及炎性細胞浸潤明顯減少，中央靜脈管腔逐漸縮小，沉積膠原蛋白逐漸減少；腎小管上皮細胞水腫減輕，腎小管擴張及萎縮病變明顯緩解。

圖2 小鼠肝臟和腎臟組織H&E和Sirius Red染色病理圖片(×200)

3 討論

肝腎綜合征是失代償期肝硬化的嚴重并發(fā)癥之一，發(fā)病率和死亡率高，嚴重危害公眾健康。隨著對肝腎綜合征病理機制的研究深入，臨床診治策略不斷發(fā)展，但是肝移植仍是目前唯一有效的最終治療手段。因此，積極尋找安全有效的治療肝腎綜合征藥物具有重要的臨床意義。

肝腎綜合征起因于嚴重的肝纖維化/硬化，如受試藥物具有良好的肝纖維化/硬化改善作用，則該藥物對肝腎綜合征可能具有良好的防治效果。本研究發(fā)現(xiàn)滸苔多糖能減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝功能失調(diào)，這與莊鑫赟報道的滸苔多糖可調(diào)節(jié)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝功能失調(diào)類似[9]；進一步的肝臟羥脯氨酸、組織H&E及Sirius red病理評價均顯示，滸苔多糖明顯減輕四氯化碳導(dǎo)致的小鼠肝臟纖維化，這就為其改善肝腎綜合征奠定了基礎(chǔ)。

肝腎綜合征是發(fā)生在嚴重肝病后期，以腎功能損傷為主要特征的一種嚴重并發(fā)癥。臨床上主要表現(xiàn)為腎血流量和腎小球濾過率下降，而腎組織往往無顯著變化[10]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，四氯化碳在誘導(dǎo)肝纖維化基礎(chǔ)上，能導(dǎo)致小鼠血清Cr、UA和UN水平顯著升高，表明小鼠腎功能失調(diào)；H&E染色結(jié)果顯示，小鼠腎小管上皮細胞有輕微水腫，局部腎小管出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，這些病變可能與腎功能失調(diào)密切相關(guān)。重要的是，滸苔多糖幾乎恢復(fù)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎功能失調(diào)，并減輕腎上皮細胞水腫及小管萎縮。這些結(jié)果表明，滸苔多糖在改善四氯化碳誘導(dǎo)的嚴重肝臟病變后，可有效恢復(fù)腎功能失調(diào)，進一步證實滸苔多糖具有良好的肝腎綜合征防治效果。

本研究局限之處在于未深入探究滸苔多糖改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝腎綜合征作用機制。但初步檢測發(fā)現(xiàn)，四氯化碳顯著降低小鼠機體的抗氧化能力，這與前期文獻報道的肝腎綜合征發(fā)生時肝腎組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)相一致[11]；而滸苔多糖能提高由四氯化碳抑制的抗氧化能力，這可能與其減輕肝腎綜合征有一定關(guān)系，但具體分子機制需后續(xù)深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，滸苔多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的肝腎綜合征具有良好的保護作用，為將滸苔多糖開發(fā)成防治肝腎綜合征新型藥物提供實驗依據(jù)。