基于多指標評價的金蕾顆粒質量標準研究

王嘉鳴，曲馨，薄雙琴，景明

(甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000)

金蕾復方是甘肅中醫藥大學劉喜平主任醫師的臨床經驗方，以“石淋要藥”之稱的金錢草(LysimachiaeHerba)、藏藥濕生扁蕾(GentianopsispaludosaMa)等配伍而成，臨床主要用于治療肝膽濕熱所致的脅痛、口苦，膽囊炎、膽管炎等[1]。君藥濕生扁蕾又名機合斗，味苦，性寒，為龍膽科扁蕾屬植物濕生扁蕾[Gentianopsispaludosa(Hook.f.) Ma]的干燥全草[2]，具有消熱解毒、利膽止瀉、祛濕退黃的功效，現臨床主要用于高血壓、急性腎盂腎炎、結膜炎的治療，藏醫常用于治療流行性感冒及膽病引發的發熱[2-5]。臣藥金錢草味甘、咸，性微寒，為報春花科植物過路黃(LysimachiachristinaeHance)的干燥全草，具有清熱解毒、利尿通淋、利濕消黃的功效，臨床常用于治療石淋、熱淋、小便澀痛、濕熱黃疸、膽脅脹痛，外用可治療癰腫疔瘡和蟲蛇咬傷[6-7]。諸藥配伍共煎，實為臨床治療膽囊炎的良方。為解決原經驗方湯劑的煎煮、儲存與攜帶方面的問題，并保留原湯劑吸收快與顯效迅速的優點，本研究選擇顆粒劑這種劑型。

本研究依據《中國藥典》2020年版顆粒劑項下相關規定對金蕾顆粒性狀、溶化性、水分、粒度進行評價，采用薄層色譜(TLC)法定性鑒別制劑中濕生扁蕾、金錢草，采用高效液相色譜(HPLC)法測定制劑中當藥黃素、木犀草素、山柰酚的含量，為金蕾顆粒質量標準的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；XPE105型分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HGZF-9203型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械有限公司)； ZF-1三用紫外分析儀(杭州齊威儀器有限公司)；SB5200D超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；GB6003-85藥典檢驗篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)。

1.2 試藥 金蕾顆粒(甘肅中醫藥大學，批號分別為20211006、20211007、20211008、20211009、20211010、20211011、20211012、20211013、20211014、20211015)；當藥黃素(批號：B20281，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；木犀草素(批號：B20888，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；山柰酚(批號：B21126，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 性狀 取金蕾顆粒10批，分別置于白紙上，觀察顏色，嗅聞氣味，加熱水溶解，嘗其味道，10批金蕾顆粒均為顆粒狀，顏色呈棕褐色，氣香，味苦。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 濕生扁蕾的鑒別[8]取3批金蕾顆粒各3 g，分別加80%甲醇100 mL，回流1 h，濾過，濾液蒸干，甲醇復溶，作為供試品溶液。同法制備對照藥材溶液和不含濕生扁蕾的陰性對照溶液。取木犀草素對照品，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。

按《中國藥典》2020年版(四部)通則0502，吸取上述6種溶液，分別點于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶6∶1∶0.7，V/V/V/V)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%AlCl3-乙醇溶液顯色，于紫外光(365 nm)下檢視，結果顯示，在圖1中A、B、C色譜在與F、D色譜相應的位置處顯示有相同顏色的熒光斑點，陰性對照在該位置處無熒光斑點，說明樣品中均含有木犀草素且陰性無干擾，詳見圖1。

A、B、C.3批顆粒供試品;D.濕生扁蕾對照藥材;E.濕生扁蕾陰性對照;F.木犀草素圖1 濕生扁蕾的薄層色譜圖

2.2.2 金錢草的TLC鑒別[8-9]取3批金蕾顆粒各3 g，分別加入80%的甲醇溶液100 mL，回流1 h，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水10 mL溶解，加稀鹽酸10 mL，水浴加熱1 h，取出，迅速冷卻，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙酸乙酯蒸干，加甲醇復溶，作為供試品溶液。同法制備對照藥材溶液和不含金錢草的陰性對照溶液。取山柰酚對照品，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。

按《中國藥典》2020年版(四部)通則0502，吸取上述6種溶液，分別點于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶1,V/V/V)作為展開劑，展開，晾干后以甲苯-甲酸甲酯-甲酸(9∶9∶2,V/V/V)再次展開，晾干，噴以3%AlCl3-乙醇溶液顯色，105 ℃加熱，于紫外光(365 nm)下檢視，結果顯示，在圖2中A、B、C色譜在與E、D色譜相應的位置處顯示有相同顏色的熒光斑點，陰性對照在該位置處無熒光斑點，說明樣品中均含有山柰酚且陰性無干擾，詳見圖2。

A、B、C.3批顆粒供試品;D.金錢草對照藥材;E.山柰酚;F.金錢草陰性對照圖2 金錢草的薄層色譜圖

2.3 檢查

2.3.1 水分 取金蕾顆粒(批號：20211006、20211008、20211010)約3 g，精密稱定，平鋪于恒重的扁平稱量瓶中，參照《中國藥典》2020年版(四部)通則0832水分測定法第二法(烘干法)測定，重復測定3次，結果見表1。結果顯示，3批顆粒的水分均小于8.0%，符合藥典規定。

表1 金蕾顆粒3批樣品水分檢查結果(%)

2.3.2 粒度 分別取10批(批號：20211006、20211007、20211008、20211009、20211010、20211011、20211012、20211013、20211014、20211015)金蕾顆粒各20 g，稱定重量，參照《中國藥典》2020年版(四部)通則0982雙篩分法測定，結果顯示10批顆粒的粒度分別為3.21%、4.79%、4.73%、3.88%、4.01%、5.22%、4.17%、3.92%，不能通過一號篩和通過五號篩顆粒占總顆粒比例均不超過15%，即金蕾顆粒粒度符合《中國藥典》顆粒劑項下規定。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件[10]色譜柱：Agilent SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動相為0.10%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)，0～10 min為A∶B=70∶30～60∶40線性洗脫，10～17 min為A∶B=60∶40～50∶50線性梯度洗脫，17～40 min為A∶B=50∶50～30∶70線性梯度洗脫，40～50 min為A∶B=30∶70等度洗脫；流速1.0 mL·min-1，檢測波長360 nm，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

A.對照品；B.供試品；C.金錢草陰性對照；D.濕生扁蕾陰性對照 1.當藥黃素；2.木犀草素；3.山柰酚圖3 金蕾顆粒樣品及陰性對照品HPLC圖

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱定當藥黃素、木犀草素、山柰酚對照品適量，甲醇溶解定容，得到質量濃度分別為0.10、0.21、0.03 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品顆粒劑(批號：20211006)2 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲(頻率40 kHz，功率900 W，40 min)溶解，放冷，加甲醇補足重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液的制備 按處方中各味藥的比例，分別稱取不含濕生扁蕾、金錢草的其他藥材，按照優選的金蕾顆粒劑的制備工藝制成顆粒制劑，再按“2.4.3”項下方法制備，即得。

2.4.5 專屬性試驗 精密吸取上述混合對照品溶液、濕生扁蕾陰性對照溶液、金錢草陰性對照溶液、供試品溶液各5 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(見圖3)。結果陰性樣品無干擾，方法專屬性良好。

2.4.6 線性關系考察 分別配制系列濃度對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品進樣質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到各成分的回歸方程、相關系數及線性范圍，得當藥黃素的線性方程：Y=12.266X-77.246，r=0.999 8，線性范圍：20.0～240.0 μg·mL-1；木犀草素的線性方程：Y=13.633X+79.111，r=0.999 9，線性范圍：24.0～288.0 μg·mL-1；山柰酚的線性方程：Y=13.48X+46.429，r=0.999 9，線性范圍：0.4～10.0 μg·mL-1，當藥黃素、木犀草素、山柰酚在該色譜條件下線性關系良好。

2.4.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄當藥黃素、木犀草素、山柰酚的峰面積，并計算相應的RSD值，當藥黃素、木犀草素、山柰酚峰面積的RSD分別為0.83%、0.67%、0.98%，表明該液相色譜儀精密度良好。

2.4.8 穩定性試驗 分別于0、4、6、8、12、24 h精密吸取混合對照品5 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，結果當藥黃素、木犀草素、山柰酚在24 h內所測峰面積的RSD分別為0.97%、1.69%、0.88%(n=6)，表明供試品溶液中當藥黃素、木犀草素、山柰酚3個指標成分室溫條件放置24 h內穩定。

2.4.9 重復性試驗 取同一批金蕾顆粒2 g，精密稱定，按照“2.4.3”供試品溶液制備方法平行制備6份，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄當藥黃素、木犀草素、山柰酚的峰面積，并計算每克顆粒中指標成分的含量，結果當藥黃素、木犀草素在金蕾顆粒中的平均含量為0.995 5、0.677 0、0.011 9 mg·g-1，RSD分別為2.27%、2.58%、3.32%(n=6)，表明重復性均良好。

2.4.10 加樣回收率試驗 取已知指標成分含量的本品顆粒6份，每份約1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，各加入含一定量當藥黃素、木犀草素、山柰酚，照“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，結果當藥黃素、木犀草素、山柰酚的平均加樣回收率分別為99.23%、99.42%、99.49%(n=6)，RSD分別為1.88%、1.32%、2.84%(n=6)，表明該方法加樣回收率符合要求，具有較好的準確性。

2.4.11 樣品測定 取10個批次的金蕾顆粒(批號：20211006、20211007、20211008、20211009、20211010、20211011、20211012、20211013、20211014、20211015)樣品，每批約2 g，精密稱定，照“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，結果見表2。結果顯示金蕾顆粒中當藥黃素、木犀草素、山柰酚平均含量分別為0.984 0、0.645 7、0.011 4 mg·g-1。

表2 金蕾顆粒中指標成分的含量(n=10)

3 討論與結論

3.1 劑型的選擇與劑型通則的研究 金蕾顆粒是在甘肅中醫藥大學劉喜平主任醫師的臨床經驗方的研究基礎上，針對藥物的運輸儲存需求研究與患者的使用研究選擇顆粒劑這一劑型。本研究參照《中國藥典》2020年版制劑通則0104中顆粒劑的有關規定，對金蕾顆粒的性狀、水分、溶化性、粒度等進行檢查，結果均符合藥典規定。

3.2 薄層色譜方法的選擇 金蕾復方的君藥為濕生扁蕾，臣藥為金錢草，故本研究將該兩味藥納入金蕾顆粒質量標準研究。濕生扁蕾作為藏藥在《中國藥典》中并未收錄，本文所引用的濕生扁蕾薄層色譜鑒別方法為前期課題組試驗摸索結果，所得薄層鑒別方法陰性無干擾，專屬性好；在金錢草的薄層鑒別中，根據《中國藥典》2020年版(一部)“金錢草”項下鑒別方法結合高效液相色譜法測定結果，陰性對照藥材相應位置出現熒光斑點，得出為假陰性現象，通過前期實驗以及查閱文獻，最終決定采用兩次展開的方法對金錢草進行薄層鑒別，所得薄層鑒別方法無陰性干擾，專屬型好。

3.3 含量測定指標的選擇 本方的主要用途為膽囊炎的治療。研究表明，本方中的君藥濕生扁蕾中的黃酮類成分有抗菌、抗氧化的作用，故選擇濕生扁蕾中黃酮類代表成分當藥黃素、木犀草素作為指標成分；而臣藥金錢草中的黃酮類能夠有效抑制并促進結石的排出，結合《中國藥典》2020年版中金錢草的含量測定指標以及初期試驗結果，選擇其中的山柰酚為指標成分[11-13]。故金蕾顆

粒的有效成分指標測定的選擇為當藥黃素、木犀草素、山柰酚。

3.4 色譜條件的選擇 在含量測定過程中，以甲醇作為提取溶劑，超聲提取40 min，用0.1%磷酸水-甲醇為流動相進行梯度洗脫，該測定方法穩定、可行。

3.5 結論 對金蕾顆粒的質量標準進行了初步研究，采用薄層色譜法確定了濕生扁蕾和金錢草的定性鑒別方法；建立了高效液相色譜法測定金蕾顆粒中當藥黃素、木犀草素、山柰酚的含量測定方法；初步擬定金蕾顆粒質量標準草案。本研究為金蕾顆粒制定了穩定、可靠的質量標準，為其質量標準研究提供了一定的參考價值。但本研究僅對金蕾顆粒做了較基礎的質量標準研究，顆粒劑微生物檢查、加速試驗還有待于檢查。