基于HPLC-MS/MS法的腦靈素制劑中人參摻偽檢查研究

穆向榮，徐興燕，焦陽(yáng)，許麗麗,2，尹雪，林永強(qiáng)*，林慧彬

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，中藥配方顆粒共性技術(shù)山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

腦靈素系列制劑包括片劑和膠囊劑2種劑型，處方組成一致，均由人參、鹿茸、黃精、淫羊藿等十五味藥組成，具有補(bǔ)氣血，健腦安神的功效。處方中人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根莖，具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫等功效[1]。近年來(lái)，多次報(bào)道西洋參冒充人參進(jìn)行含人參制劑的投料生產(chǎn)[2-3]。西洋參為五加科植物西洋參(P.quinquefoliumL.)的干燥根，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津的功效[1]。兩味藥材性味、臨床應(yīng)用和功能主治互不相同，所含皂苷種類與含量及比例有一定的差異[4-9]，若用西洋參摻入人參或直接充作人參進(jìn)行投料生產(chǎn)，可能會(huì)影響制劑的有效性。研究發(fā)現(xiàn)西洋參中擬人參皂苷F11含量較高，而人參中基本不含，因此，擬人參皂苷F11可作為非法投料使用的依據(jù)。

1 儀器、試劑與樣品

儀器：AB SCIEX Triple Quad 6500+高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；島津8050三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；Sartorius CP225D電子天平。

試劑：乙腈、為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

對(duì)照品：擬人參皂苷F11(中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院提供，批號(hào)：110841-201617；上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：3711；成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-21051408；上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)：22B211-B2)。

參比樣品及陰性對(duì)照樣品：本課題組按照規(guī)定的處方量及工藝自制腦靈素膠囊、片各1批，作為參比樣品使用；自制缺人參藥味的腦靈素膠囊、片各1批，作為陰性樣品使用。

人參、西洋參購(gòu)于河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)，經(jīng)宋希貴主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱內(nèi)徑2.1 mm)；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速為0.35 mL·min-1；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧負(fù)離子模式(ESI-)，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表2。

表2 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能量

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取擬人參皂苷F11(中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院提供，批號(hào)：110841-201617)10.79 mg，置100 mL量瓶中，加20%乙腈使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為擬人參皂苷F11對(duì)照品貯備溶液(C濃度=0.107 9 mg·mL-1)。精密量取適量，用20%乙腈稀釋制成每1 mL含4 ng的溶液，即得。

精密稱取不同來(lái)源的擬人參皂苷F11對(duì)照品(上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：3711；成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-21051408；上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)：22B211-B2)適量，同法制備對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取腦靈素片適量，除去糖衣；或取腦靈素膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流75 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4 測(cè)定 分別精密吸取上述對(duì)照品及供試品溶液各5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液制備：照“2.3.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液制備方法制備。

陰性對(duì)照溶液的制備：取人參陰性樣品1 g，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

參比溶液的制備：取參比樣品1 g，按供試品溶液的制備方法制得參比溶液。

陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備：取人參陰性樣品1 g和西洋參6.7 mg(相當(dāng)于1 g制劑中人參藥材的處方量)，制備陽(yáng)性制劑，再按供試品溶液的制備方法制得陽(yáng)性樣品溶液。

西洋參供試品溶液的制備：取西洋參6.7 mg，按供試品溶液的制備方法制得西洋參樣品溶液。

分別精密吸取上述溶液各5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)參比樣品和陰性樣品均未檢出擬人參皂苷F11成分，陽(yáng)性樣品和西洋參藥材中均檢出擬人參皂苷F11成分，說(shuō)明腦靈素制劑中其他藥味對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。選擇離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn) (自上往下依次為：擬人參皂苷F11對(duì)照品、陰性樣品、參比樣品、陽(yáng)性樣品、西洋參藥材；左側(cè)為m/z 799.6→653.6離子，右側(cè)為m/z 799.6→491.6離子)

3.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 腦靈素制劑處方復(fù)雜，藥味較多，且處方中人參投料量較低，故需對(duì)制劑基質(zhì)效應(yīng)考察。試驗(yàn)中，以自制參比樣品按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法得到基質(zhì)溶液2 mL，精密加入2.158 μg·mL-1人參皂苷F11對(duì)照品溶液10 μL，混勻，即得含107.9 ng·mL-1擬人參皂苷F11的基質(zhì)溶液。再用20%乙腈溶液制的相同濃度的擬人參皂苷F11溶液，同時(shí)進(jìn)樣比較。結(jié)果表明，腦靈素樣品基質(zhì)溶液使待測(cè)成分的響應(yīng)值明顯降低，基質(zhì)效應(yīng)明顯。在限度制定和相關(guān)方法學(xué)考察時(shí)應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 基質(zhì)效應(yīng)考察數(shù)據(jù)

圖2 基質(zhì)考察試驗(yàn) (上圖為20%乙腈溶液，下圖為腦靈素樣品基質(zhì)；左側(cè)為m/z 799.6→653.6離子，右側(cè)為m/z 799.6→491.6離子)

3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為43.16 ng·mL-1的擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 選取陽(yáng)性樣品(批號(hào)：200403)，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定，以m/z 799.6→653.6離子峰面積值，計(jì)算重復(fù)性。結(jié)果顯示，方法重復(fù)性良好。

3.5 回收率試驗(yàn) 考慮到基質(zhì)效應(yīng)對(duì)待測(cè)成分峰面積影響大，本實(shí)驗(yàn)室以自制參比樣品按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法得到基質(zhì)溶液，以此來(lái)制備系列對(duì)照品溶液(10.79、21.58、43.16、107.9、215.8、431.6 ng·mL-1)。精密吸取上述系列基質(zhì)對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。以m/z 799.6→653.6離子峰面積值為縱坐標(biāo)，以擬人參皂苷F11濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果可見(jiàn)，擬人參皂苷F11濃度在10.79～431.6 ng·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好，回歸方程Y=461.68X-1 797.7,r=0.999 2。

將重復(fù)性項(xiàng)下樣品測(cè)定峰面積帶入上述回歸方程計(jì)算含量為11.83 μg·g-1。取同批次陽(yáng)性樣品0.5 g，平行制備6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加80%甲醇25 mL，再分別精密加入1.079 μg·mL-1的擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液0.5 mL，稱定重量，置80 ℃水浴中加熱回流75 min，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定m/z 799.6→653.6離子峰面積值，計(jì)算回收率。

結(jié)果顯示，回收率平均值為99.3%，RSD為45%方法精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性考察 取4.316 ng·mL-1的擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液，分別于制備后0、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，以m/z 799.6→653.6作為檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定。取陽(yáng)性樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，常溫保存，分別于制備后0、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，以m/z 799.6→653.6，作為檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行測(cè)定。

結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可以滿足檢測(cè)需要。

3.7 檢測(cè)限 以響應(yīng)值相對(duì)較低的m/z 799.6→491.6作為檢測(cè)離子進(jìn)行檢測(cè)，濃度為0.025 18 ng·mL-1的擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液上述離子的信噪比約為3。

3.8 色譜柱耐用性試驗(yàn) 對(duì)不同色譜柱型號(hào)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，3種型號(hào)的色譜柱均能實(shí)現(xiàn)擬人參皂苷F11的測(cè)定，該方法對(duì)色譜柱耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表4和圖3。

表4 不同型號(hào)色譜柱考察

圖3 色譜柱考察選擇離子流色譜圖 (自上往下依次為：色譜柱編號(hào)1、2、3；左側(cè)為m/z 799.6→653.6離子，右側(cè)為m/z 799.6→491.6離子)

3.9 儀器耐用性試驗(yàn) 為了適應(yīng)不同靈敏度的儀器，考察本方法在島津8050三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀和AB 6500+高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上的重現(xiàn)性，離子流色譜見(jiàn)圖7～8。結(jié)果表明擬人參皂苷F11成分在上述儀器上可檢出，本方法對(duì)儀器耐用性良好。

3.10 摻偽比例考察 據(jù)研究報(bào)道，人參藥材中可檢測(cè)出少量擬人參皂苷F11，其含量遠(yuǎn)低于西洋參。同時(shí)也存在由于客觀原因，人參中混入少量西洋參的情況，因此對(duì)人參中摻入不同比例西洋參后的制劑檢測(cè)情況進(jìn)行考察。

將人參藥材中加入適量西洋參，分別制成含3%、5%、10%西洋參的人參混合樣品，分別稱取上述人參混合樣品6 mg，再加入腦靈素陰性對(duì)照樣品1 g，混勻，按“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液。分別精密吸取上述溶液各5 μL，注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測(cè)定。

結(jié)果顯示，當(dāng)人參中西洋參摻入量為3%、5%時(shí)，響應(yīng)值相對(duì)較低的m/z 799.6→491.6檢測(cè)離子信噪比均小于3，視為未檢出；當(dāng)摻入量為10%時(shí)，m/z 799.6→491.6檢測(cè)離子信噪比大于3，視為檢出。

4 結(jié)果測(cè)定

按照上述擬定檢驗(yàn)方法，對(duì)66批腦靈素制劑樣品進(jìn)行檢查，結(jié)果36批樣品檢出擬人參皂苷F11成分，檢出率為54.5%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 腦靈素制劑擬人參皂苷F11檢查結(jié)果

表5(續(xù))

5 討論

5.1 不同來(lái)源對(duì)照品對(duì)檢出結(jié)果的影響 為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別用不同來(lái)源的擬人參皂苷F11對(duì)照品配制對(duì)照品溶液，對(duì)66批腦靈素制劑樣品進(jìn)行檢查，擬人參皂苷F11檢出結(jié)果一致，說(shuō)明不同來(lái)源的對(duì)照品對(duì)樣品檢出結(jié)果無(wú)影響。

5.2 結(jié)果分析 現(xiàn)行版藥典規(guī)定的人參與西洋參來(lái)源不同，兩味藥材性味、臨床應(yīng)用和功能主治互不相同，所含皂苷種類與含量及比例有一定的差異。前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不法商家用西洋參邊角料冒充人參，用于含人參的中藥制劑。若用西洋參摻入人參或直接充作人參進(jìn)行投料生產(chǎn)，可能會(huì)影響制劑的有效性。本試驗(yàn)建立的液質(zhì)聯(lián)用的檢查方法能夠準(zhǔn)確判定腦靈素制劑中是否存在西洋參邊角料冒充人參使用的問(wèn)題，可為腦靈素類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。