ALKBH5對人肝癌細胞上皮間質轉化的影響

孫姚承, 湯建軍, 魏 來, 杭蘇寧,倉 杰, 王夢濤, 奚劍波

(1. 江蘇大學附屬武進醫院/徐州醫科大學武進臨床學院 普通外科, 江蘇 常州, 213002;2. 江蘇大學醫學院, 江蘇 鎮江, 212013)

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥相關性死亡的主要原因[1]。肝癌起病隱匿, 70%～80%的肝癌患者確診時己是晚期，經診斷后平均存活時間僅約6個月, 5年總生存率低于19%[2]。目前，臨床治療肝癌的主要方法有外科手術肝臟切除、介入治療、肝移植、化療等，外科手術肝臟切除為首選治療方法[3]。但肝癌患者肝切除后5年復發率高，其初期癥狀不明顯，不能早期篩查，多數發現時已處于中晚期，且已無手術指征[4]。當前肝癌治療效果不佳，是由于其腫瘤形成的分子機制尚不清楚。因此，臨床人員亟需揭示肝癌發生發展的機制，尋找有效的治療方式以改善肝癌患者預后。

N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾普遍存在于各種類別的RNA中，其中以信使RNA較為多見，表觀轉錄組學研究[5]發現，其豐度水平直接影響轉錄后的表達。ALKBH5作為m6A修飾中非常重要的一個元件，其與多種腫瘤的臨床預后有關，通過不同的分子機制影響腫瘤的進程。但ALKBH5在肝癌進程中的作用尚未闡明，故本研究挖掘了ALKBH5的表達與臨床各項指標參數的內在關系，成功構建shRNA干擾質粒，篩選出穩定低表達ALKBH5的細胞株，探討ALKBH5對肝癌細胞生物學功能中遷移、侵襲及上皮間質轉化(EMT)作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養及轉染: 本實驗中所用的正常肝細胞系LO2以及2種肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2由江蘇大學附屬武進醫院中心實驗室保存，所用培養基為DMEM與10%胎牛血清混合而成，在恒溫、恒濕培養箱內孵育。在www.sigmaaldrich.cn/網站找到驗證后的shALKBH5 oligos序列，上游序列5′-CCGGGAAAGGCTGTTGGCATCAATACTCGAGTATTGATGCCAACAGCCTTTCTTTTG -3′, 下游序列5′-AATTCAAAAAGAAAGGCTGTTGGCATCAATACTCGAGTATTGATGCCAACAGCCTTTC-3′。按照慢病毒包裝試劑盒說明書，使用pLKO.1-TRC載體質粒、穿梭質粒psPAX2和包裝質粒pMD2. G共同構建相應質粒，同時把干擾質粒sh-EGFP/sh-ALKBH5及其他2種質粒共轉染入293T細胞，轉染4～6 h后更換為培養基，放入溫箱孵育，細胞培養2 d后，吸管吸取富含慢病毒顆粒的培養基液體備用。

轉染前24 h, 取適當的處于對數生長期的細胞消化，用完全培養基重懸后將數量合適的細胞接種至6孔板中(大約為5×105個/孔)，保證細胞在孔中分布均勻。轉染前30 min, 吸管吸去培養皿中原有液體，加入新鮮的DMEM培養基，要求不含有抗生素及血清。根據分組配制慢病毒轉染液，加入相應培養孔中，輕輕晃動混勻，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續進行培養。4～6 h后吸管吸去培養皿中原有液體，培養箱中繼續孵育24～48 h。

1.1.2 主要試劑: DMEM、反轉錄試劑盒、ECL試劑盒均由美國Thermo公司生產; 兔抗人EMT抗體試劑盒購自美國Cell Signaling公司; LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司; 30%丙烯酰胺購自中國上海Takara公司產品; Tris-HCl(pH值8.8、pH值6.8)為中國康為世紀公司產品; Marigel基質膠購自美國BD公司; 2×SYBR Green實時定量PCR預混合溶液購自美國Bioworld公司; Transwell小室購自美國Corning公司; 鼠抗人β-Tubulin購自美國Santa Cruz公司; RNA抽提Trizol試劑由Takara中國大連有限公司生產; 胎牛血清購自美國Gibco公司; PVDF膜購自美國Millipore公司; 引物合成購自南京金斯瑞生物科技公司; 鼠抗人ALKBH5抗體購自美國Sigma公司。

1.1.3 納入病例: 本實驗采集2016年1月—2020年1月江蘇大學附屬武進醫院收治的50例肝癌患者的肝癌組織，所有患者均簽署知情同意書。納入標準: 在本科進行手術治療者，手術病理結果為肝細胞癌者; 術前預計生存時間大于3月者。排除標準: 已接受肝癌手術治療者; 已接受肝動脈化療栓塞術(TACE)治療或化療者; 合并其他惡性腫瘤疾病者。具體實施計劃、方案經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR): 細胞RNA提取的步驟參考Trizol試劑說明書，隨后進行PCR建立實時擴增曲線。qRT-PCR反應條件: 98 ℃預變性30 s; 98 ℃變性10 s; 56 ℃退火30 s; 72 ℃延伸10 s，所有步驟40個循環，合成產物置于冰上保存。ALKBH5上游引物序列5′-CACATCCTGGAAGGCAGCAA-3′, 下游引物序列5′-CCCCCAAAGTGGTGGTATCC-3′。GAPDH上游引物序列5′-TGGGGAAGGTGAAGGTCGG-3′, 下游引物序列5′-CTGGAAGATGGTGATGGGA-3′。本實驗將目的基因表達量作為1, 數據結果用2-△△Ct表示,GAPDH作為內參，所有樣品均有復孔, 3次獨立實驗。

1.2.2 蛋白質免疫印跡(Western blot): 轉染48 h后收集對照組與實驗組細胞, 100 ℃煮沸10 min, 12 000轉/min離心5 min。10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 分離后的蛋白質在低溫調節為300 mA電流移動黏附到膜上; 轉膜2 h后，將膜取出，常溫下5%脫脂牛奶封閉1 h, 洗膜緩沖液(TBST)洗膜2次，根據分子量切下目標蛋白所處膜，一抗4 ℃孵育過夜; 洗膜3次完成后，常溫下二抗孵育1 h, 結束后洗膜3次。濾紙吸干所有液體，滴上適量ECL發光液涂抹均勻，拍照、顯影、儲存。

1.2.3 Transwell遷移及侵襲實驗: 對照組和實驗組細胞分別轉染相應質粒, 48 h后以0.25%胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次, 600轉/min離心4 min, 棄上清液。加600 μL無血清DMEM重懸細胞，計數板計數細胞，將1×106細胞種入Transwell小室上層(遷移實驗不含基質膠，侵襲實驗含有基質膠)，小室下層加入500 μL含血清的DMEM, 置于細胞培養箱孵育。36～48 h后將小室取出，吸盡培養基，將小室于4%多聚甲醛固定20 min, 結晶紫染色30 min, 觀察拍照，計數細胞遷移數，結果取平均值。

1.2.4 免疫組化: 切片烤片并脫蠟，檸檬酸鹽修復抗原封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗免疫顯色試劑37 ℃孵育30 min, DAB染色，蘇木精復染，乙醇去水，中性膠密封，高倍顯微鏡視野下結合色澤強弱和陽性細胞所占總細胞數百分比實行半定量檢測。不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色則為3分；陽性細胞數<5%為0分, 5%～25%為1分, >25%～50%為2分, >50%～75%為3分, >75%～100%為4分。評分相乘作為分組標準, 0分為陰性, 1～4分為弱陽性, 5～8分為陽性, 9～12分為強陽性。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 ALKBH5蛋白水平與肝癌患者臨床病理特征的關系

根據免疫組化半定量將標本分為高表達組(陽性和強陽性)、低表達組(陰性和弱陽性)。ALKBH5表達與臨床分期、腫瘤分化程度存在相關性(P<0.05), 與血清甲胎蛋白(AFP)水平、腫瘤大小、年齡、性別均無相關性(P>0.05), 見表1。

表1 ALKBH5蛋白水平與肝癌患者臨床病理特征的關系

2.2 ALKBH5在肝癌細胞中的表達及獲得穩定低表達細胞株

qRT-PCR結果顯示，在肝癌細胞系HepG2、SMMC7721中,ALKBH5mRNA相對表達量分別為1、(2.47±0.35); 人正常肝細胞LO2中ALKBH5mRNA相對表達量為(3.87±0.55)。Western blot檢測結果見圖1A。

為了獲得穩定低表達的細胞株，將已感染慢病毒的細胞用高濃度嘌呤霉素篩選，后將存活的細胞以低濃度嘌呤霉素維持培養至對數生長期，收獲蛋白質及總RNA。HepG2和SMMC7721細胞實驗組(sh-ALKBH5)ALKBH5蛋白質水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05); HepG2和SMMC7721細胞干擾組ALKBH5mRNA水平分別為(0.38±0.03)、(0.29±0.04), 均低于對照組(sh-EGFP), 差異有統計學意義(P<0.05), 干擾效果明顯。見圖1B。

A: ALKBH5在肝癌細胞中的表達情況; B: ALKBH5在肝癌細胞中敲低效率驗證。與對照組比較, **P<0.01。圖1 在肝癌細胞中ALKBH5 mRNA表達和ALKBH5蛋白表達

2.3 下調ALKBH5基因促進HepG2和SMMC7721細胞遷移、侵襲

Transwell遷移試驗顯示, HepG2細胞中對照組和實驗組的每高倍鏡視野(200倍)下穿透細胞數為(123±22)、(335±21)個; SMMC7721細胞中對照組和實驗組的每高倍鏡視野(200倍)下穿透細胞數為(220±27)、(453±23)個。Transwell侵襲試驗顯示, HepG2細胞中對照組和實驗組的穿透細胞數為(118±29)、(282±17)個; SMMC7721細胞中對照組和實驗組的穿透細胞數為(200±11)、(388±20)個, 2組間差異均有統計學意義(P<0.05), 見圖2。由此表明，下調ALKBH5基因，肝癌細胞HepG2和SMMC7721細胞遷移和侵襲能力受到促進。

A: Transwell實驗檢測下調ALKBH5對HepG2和SMMC7721細胞遷移能力的影響; B: Transwell實驗檢測下調ALKBH5對HepG2和SMMC7721細胞侵襲能力的影響。與sh-EGFP比較, **P<0.01, ***P<0.001。圖2 下調ALKBH5對HepG2和SMMC7721細胞遷移、侵襲能力的影響

2.4 下調ALKBH5基因促進HepG2和SMMC7721細胞上皮間質轉化(EMT)

下調ALKBH5表達水平后, Western blot檢測結果顯示，上皮表型標志物E-cadherin蛋白表達水平降低，間質表型標志物Vimentin、Snail蛋白表達水平增高，說明下調ALKBH5表達水平促進了肝癌細胞的EMT。見圖3。

圖3 下調ALKBH5對HepG2和SMMC7721細胞EMT相關蛋白表達的影響

3 討 論

N6-甲基腺嘌呤修飾是眾多轉錄后調控事件的一種，與其他RNA修飾相比，動態可逆性調控使其具有獨特的生物學功能[6]。最新的m6A修飾測序技術[7-9]發現，大量m6A修飾位于長鏈的外顯子和終止密碼子附近, m6A修飾和其他mRNA轉錄后的加工修飾過程類似，如剪接除去內含子、3′-端加上多聚核苷酸、5′-端加上m7GTP的結構等，均是通過m6A甲基轉移酶復合物來實現轉錄后的修飾[10]。m6A修飾的調控是通過一些被稱為“書寫器”(writer)的甲基轉移酶，如甲基轉移酶樣3(METTL3)、Wilms′腫瘤蛋白1相關蛋白(WTAP)和甲基轉移酶樣14(METTL14), 一些被稱為“擦除器”(eraser)的脫甲基酶，如脂肪量和肥胖相關基因(FTO)和ALKBH5, 以及一些被稱為“閱讀器”(reader)的識別蛋白，如YTH結構域m6A RNA結合蛋白1(YTHDF1)、YTH結構域m6A RNA結合蛋白2(YTHDF2), 以實現動態可逆的平衡[11]。研究[12-15]顯示，參與m6A修飾的各種元件一直被認為和癌癥的發病有密切關系，如WTAP是白血病的一個關鍵性抗原;FTO基因突變會增高結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌的發病風險，前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌的發生也與FTO等位基因的變異有直接關系;METTL3的磷酸化作用可以導致細胞DNA損傷和腫瘤形成。近年來研究[16]指出, m6A修飾在癌癥的初始階段和轉移復發過程中扮演了非常重要的角色。

ALKBH5作為m6A修飾中非常重要的一個元件，與多種腫瘤的臨床預后有關，通過不同的分子機制影響腫瘤進程。研究[17]發現,ALKBH5過表達能夠降低干性基因胚胎干細胞關鍵因子(NANOG)mRNA甲基化的水平，增加NANOG的表達以及乳腺癌干細胞的豐度，誘導缺氧表型的發生; 在乳腺癌干擾ALKBH5的水平后，裸鼠體內腫瘤形成的能力明顯減弱[17]。另一研究[18]發現,ALKBH5高表達與腦惡性膠質患者的臨床預后有關,ALKBH5通過提高叉頭框轉錄因子M1(FoxM1)起始區域內去甲基化水平，增高了FoxM1轉錄后表達，誘導了膠質母細胞瘤的干性,ALKBH5-FoxM1軸在增殖及體內成瘤過程中發揮關鍵性的作用。在胰腺癌中,ALKBH5可作用于LncRNA KCNK15-AS1, 進而抑制腫瘤細胞的遷移能力[19], 但其對肝癌細胞的影響及作用的相關報道較少。

本研究發現，肝癌中ALKBH5蛋白表達與分化程度、臨床分期存在負相關，與性別、年齡、腫瘤大小、血清AFP水平均無相關性，提示ALKBH5與肝癌的臨床預后密切相關;ALKBH5在2種肝癌細胞株中差異性表達，且顯著低于正常肝細胞LO2。本研究分別選擇2種不同的肝癌細胞系(HepG2和SMMC7721細胞)進行基因沉默實驗，以探討ALKBH5對肝癌細胞的影響; 在此基礎上，進一步檢測了細胞遷移、侵襲能力變化。結果表明，抑制ALKBH5表達, HepG2和SMMC7721細胞的遷移和侵襲能力顯著增強，說明ALKBH5對于肝癌的遷移、侵襲作用有顯著影響，但其具體作用機制仍然不清楚。

EMT是一個特有過程，上皮細胞經過一系列的分子生物改變，逐漸失去排列極性、細胞與細胞間存在緊密連接、附著力等特征，由不能移動的上皮細胞轉變成為具有遷移、侵襲的能力的間質細胞。EMT是腫瘤轉移過程中的重要限速環節，在腫瘤的侵襲和轉移進程中發揮重要作用[20]。本研究表明，下調ALKBH5表達水平后，上皮表型標志物E-cadherin蛋白表達水平降低，間質表型標志物Vimentin、Snail蛋白表達水平增高。E-cadherin的主要功能是維持上皮細胞形態完整性，其是存在于人和動物上皮的一種鈣依賴性細胞黏附分子; E-cadherin可以在多個環節影響腫瘤侵襲轉移，表達減少或缺失可導致細胞失去原有的形態，細胞間相互融合能力下降，進而移動性增加; 在上皮性腫瘤中，突破上皮和基底膜的限制，通過內滲進入周圍組織細胞轉移或侵入淋巴管血管，這些血液循環腫瘤細胞到達目的區域后，借助間質上皮過程完成侵略過程，故E-cadherin是防止腫瘤向惡性轉化、發生侵襲轉移的一種保護性因子[21]。Snail在病理狀態(尤其是癌癥中)常呈現過度表達狀態，研究[22]發現, Snail的核轉運參與調節EMT，可以特異性識別E-cadherin的啟動子區域后結合，在轉錄水平抑制其表達，繼而啟動EMT。同時, Snail可以聯合SMAD同源物3/SMAD同源物4(Smad3/Smad4)影響蛋白激酶B(AKT)與E-cadherin結合，表達水平受到核轉錄因子-κB(NF-κB)、轉化生長因子-β/Smad(TGF-β/Smad)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、糖原合酶激酶-3 (GSK-3β)等多條復雜的信號通路調節，并促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移。本研究未探討ALKBH5抑制EMT進程的信號通路及具體機制，還需進一步深入研究。

綜上所述,ALKBH5與臨床預后密切相關，且能夠顯著抑制肝癌細胞遷移、侵襲及EMT, 提示ALKBH5作為一種抑癌基因參與肝癌的發生發展過程，但其具體分子機制有待進一步研究。同時，通過靶向藥物來逆轉肝癌細胞的轉移復發有望為肝癌治療提供新思路。