三硝基苯磺酸誘導急性腸纖維化大鼠模型的改良方法

王怡如, 蔣笑影, 董若曦, 潘一濱, 韓向暉, 曹永清

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院肛腸科, 上海 200032; 2. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所, 上海 200032)

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）和潰瘍性結腸炎，其特征是在遺傳易感個體的消化道中存在長期持續(xù)的炎癥。腸纖維化是CD病程中的常見并發(fā)癥，表現(xiàn)為腸腔狹窄和腸壁增厚，在上下消化道均可發(fā)生，以回腸末端、回盲瓣、肛直腸段多見；半數CD患者存在發(fā)生腸腔狹窄的終身風險，纖維化使器官失去正常結構及功能，嚴重的狹窄是導致手術和腸切除的主要原因之一［1-2］。既往認為，CD患者的腸纖維化是一個相對緩慢的過程，故腸纖維化動物模型多以周期性反復引發(fā)炎癥建立的慢性纖維化為主。但近期研究顯示，纖維化病變在部分CD患者中迅速發(fā)展，形成狹窄的速度可能比以往認為的早得多［3］。因此，對CD患者急性腸纖維化的研究已成為該領域的重點之一，建立符合CD患者腸纖維化疾病特征的動物模型是研究該疾病發(fā)生機制和治療方法的主要途徑和重要需求。

半抗原化劑2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）灌腸誘導的結腸炎模型是研究CD 最常用和最具特征性的模型之一［4］，但其誘導的急性腸纖維化模型目前在國內未見探討。基于這一廣泛驗證的模型基礎，本課題探索了一次性保留灌腸建立急性腸纖維化大鼠模型的改良方法，同時設立多組不同藥物劑量和乙醇溶液濃度的配比以觀察誘導的大鼠結腸炎癥和纖維化效果差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雌性SD 大鼠30 只，體質量為200～220 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（浙）2019-0001］，質量合格證為20210107Aazz061900 882。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心［SYXK （滬） 2020-0009］，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對濕度為40%～60%，光/暗每12 h交替，滅菌全價營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。本研究方案經上海中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（PZSHUTCM201225008），實驗過程符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

TNBS（批號SLCG2384）和戊巴比妥鈉（批號57-33-0） 均購自美國Sigma 公司；無水乙醇（批號20191017）、苯胺藍（批號20190604）、磷鉬酸（批號20190626）和正丁醇（批號20190802）均購自國藥集團化學試劑有限公司（滬試）；雙蒸水和生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）（批號S2005066）購自上海百特醫(yī)療用品有限公司；多聚甲醛（批號202201）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；伊紅（批號C201103）、蘇木精（批號C201204）和BASO糞便隱血雙聯(lián)法試劑組（批號BA-2020E）購自珠海貝索生物技術有限公司；Weigert鐵蘇木素（批號20200407）購自北京索萊寶科技有限公司；二甲苯（批號2021033102）購自上海盛稀化工有限公司。

手術器械購自上海醫(yī)療器械（集團）有限公司手術器械廠（金鐘手術器械）；一次性無菌注射器購自威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司；L80 型一次性直腸給藥管購自任丘市洪達氣體有限公司（綠林）；組織包埋機和石蠟切片機為德國Leica公司產品；光學顯微鏡為日本Olympus公司產品。

1.3 藥品配制及動物分組

將無水乙醇與雙蒸水按相應體積比配制成體積分數為50%和75%的乙醇溶液。5%TNBS 分別與不同體積分數的乙醇混合配制成體積比為1∶1 的5%TNBS+50%乙醇溶液（A 組）、體積比為1∶1 的5%TNBS+75%乙醇溶液（B 組）、體積比為1∶1 的5%TNBS+無水乙醇溶液（C 組），以及體積比為2∶1 的5%TNBS+50%乙醇溶液（D組）。4個不同配比的TNBS/乙醇溶液配制后，在4 ℃冷藏避光保存，使用前再次混勻。

30 只雌性SD 大鼠隨機分為5 組，每組6 只。對照組予生理鹽水0.6 mL 灌腸，模型組分為A、B、C、D組，用上述對應配比的溶液各0.6 mL灌腸。

1.4 一次性保留灌腸法建立炎性腸纖維化大鼠模型

各組大鼠適應性飼養(yǎng)1 周，第7 天起禁食不禁水24 h，第8 天造模前稱重。造模麻醉前再次促進大鼠排便。造模時，先用2%戊巴比妥鈉溶液按每只大鼠0.3～0.4 mL 的用藥量進行腹腔注射麻醉。麻醉起效后參考Morris法［5］進行一次性灌腸操作，改良方法：用1 mL 注射器連接圓頭灌腸軟管（長8 cm，內徑2 mm）制作灌腸器；麻醉后的大鼠以俯臥位提起大鼠尾部，暴露肛門，灌腸管蘸取少許造模藥液潤滑管壁，插入肛門約8 cm 處，緩慢勻速推注藥液0.6 mL；退出灌腸管后立即用木夾子夾閉大鼠肛門，并將大鼠呈頭低位尾部固定于籠網；保持肛門夾閉狀態(tài)，計時30 min 后取下夾子將大鼠放回籠中，待其自然蘇醒（圖1）。

圖1 大鼠保留灌腸示意圖Figure 1 Schematic diagram of retention enema

1.5 造模后動物一般情況觀察

記錄造模后7 d內大鼠每日精神及活動狀態(tài)、體質量變化、糞便性狀及便血、死亡情況，并參照Murano等［6］方法進行大鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分。（1）體質量下降：無，記0 分；1%～5%，記1 分；6%～10%，記2 分；11%～15%，記3 分；＞15%，記4 分。（2）糞便性狀：正常，記0分；松散，記2 分；稀便，記4 分。（3）便血：隱血（-），記0分；隱血（+），記2分；肉眼血便，記4分。DAI=（體質量下降分數+糞便性狀分數+便血分數）/3，以造模當日體質量作為初始體質量，與造模后第1 天起每日體質量作對比。

1.6 造模后實驗動物取材與樣本保存

造模后第7天、第14天，用2%戊巴比妥鈉溶液按每只大鼠0.7～0.8 mL的用藥量腹腔注射麻醉每組一半大鼠。麻醉前不禁食不禁水。麻醉起效后，沿腹中線剖開腹腔并觀察腹腔內情況；經腹主動脈采血后，以脫頸椎法安樂死大鼠；然后取下肛門至盲腸全段，于造模給藥處（距肛門6～10 cm 范圍）剪斷腸管；沿腸管縱軸剖開，必要時用生理鹽水沖洗腸腔殘留糞便，觀察腸道炎癥最明顯處；測量后截取該部位結腸組織，固定于多聚甲醛溶液中，留做病理切片。若全結腸未見明顯肉眼下大體形態(tài)改變，則截取距肛門1 cm、3 cm、6 cm、9 cm范圍內的結腸腸段0.3 cm作為樣本。

1.7 結腸組織大體形態(tài)學觀察

取材時記錄腹腔積液、病變腸管與周圍組織關系等，無張力拉直腸管后測量從肛門到結腸盲腸交界處的全結直腸長度。然后觀察腸管外壁有無穿孔、狹窄、膨大、粘連等改變，沿縱軸剖開腸管后觀察腸腔面。綜合以上信息，參考Butzner 等［7］方法進行大鼠結腸炎大體損傷指數（colon macroscopic damage index，CMDI）評分。（1）結腸損傷：正常外觀，記0 分；局灶充血但黏膜無糜爛或潰瘍，記1 分；潰瘍不伴充血或腸壁增厚，記2分；一處潰瘍伴炎癥，記3分；兩處及以上的局灶潰瘍或炎癥，記4 分；主要炎癥損傷處沿腸管縱向延伸范圍＞1 cm，記5 分；損傷范圍＞2 cm，每增加1 cm 再多記1 分，即記6～10 分。（2）結腸與周圍組織關系：與周圍組織無粘連，記0 分；輕度粘連（與周圍組織易于分離），記1分；重度粘連（與周圍組織不易分離），記2 分。評分由兩位研究者分別獨立進行，再對結果進行比較分析。

1.8 HE染色和Masson染色

各組炎癥結腸組織以多聚甲醛溶液固定后，經常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水等步驟制作病理切片，同一塊結腸組織分別切片進行HE 染色和Masson 染色，光學顯微鏡下取腸壁全層視野，觀察黏膜損傷程度、腸壁增厚、炎細胞浸潤深度、纖維化部位等情況，并比較對照組與模型組的膠原蛋白沉積部位和范圍。

1.9 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，并用Graphpad Prism 8.0 軟件作圖。計數資料以率描述，計量資料以±s描述。資料服從正態(tài)分布時，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，并以LSD-t檢驗進行兩兩比較。若資料不服從正態(tài)分布，則多組間比較采用Kruskal-Wallis 非參數檢驗，以Dunn 法作進一步比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模后大鼠一般情況

造模后，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，表現(xiàn)為反應慢、掙扎減弱、喜聚集、蜷縮、鼠毛暗淡，且肛周有稀便污染；持續(xù)1～3 d 后，整體情況隨體質量升高逐漸好轉。適應期及造模當日，各組大鼠體質量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；造模前禁食24 h 后，大鼠體質量較前平均下降（18.3±8.7）g。造模完成后，對照組在進食后體質量迅速回升，模型組體質量持續(xù)下降1～2 d 后才開始緩慢回升。與對照組相比，模型組造模后第1、2天的體質量明顯偏低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01，圖2A）。

造模24 h 后，模型組均可見糞便性狀改變，便質稀或呈糊狀，伴黏液及血跡。肉眼見血便多數持續(xù)2～3 d；隱血陽性在肉眼血便消失后仍存在1～3 d；稀便持續(xù)時間每組不等，A 組3～6 d，B 組3～7 d，C組4～7 d，D組模型不穩(wěn)定，持續(xù)1～14 d。造模后24 h各模型組的DAI 評分均較對照組明顯升高，其中B 組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2B）；造模后24 h 各模型組的DAI 評分均逐漸下降，但各模型組之間DAI 評分比較的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2B）。

圖2 造模后大鼠體質量變化趨勢（A）和疾病活動指數評分（B）Figure 2 Changes in rat body mass（A）and disease activity index(B)after model establishment

2.2 模型動物死亡率

A 組與B 組觀察期內大鼠無死亡。C 組造模后第2天和第6 天各有1 只大鼠死亡，D 組造模后第3 天有2只大鼠死亡，C組與D組死亡率均為33.3%。

2.3 結腸大體外觀

對照組結腸正常，腸管外壁與周圍組織易于分離。模型組各組大鼠可見不同程度的結腸炎改變，造模給藥處可見局部腸管膨隆，腸段增厚明顯，腸管質韌，腸管外壁均未見穿孔，造模部位腸管外壁與周圍器官組織炎性粘連，嚴重病變腸管外出現(xiàn)脂肪組織蓄積、包裹，不易分離。模型組之間對比，A 組的結腸外觀變化總體較輕；B、C組節(jié)段性增厚較明顯，可伴上段腸管擴張，出現(xiàn)不完全性腸梗阻；D 組內模型差異較大，部分出現(xiàn)明顯的炎性狹窄性病變，部分未見明顯異常（圖3）。

圖3 模型建立后的大鼠結腸組織Figure 3 Colonic tissue of rats after model establishment

2.4 結腸長度及形態(tài)學改變

對各組大鼠結腸長度進行測量，結果見圖4A。對照組大鼠結腸長度為16～18 cm，各模型組結腸長度總體均較對照組縮短，其中A、B、C 三組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），D組結腸長度變化與對照組相比無明顯差異，A、B、C 三組間對比的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

縱向剖開腸管觀察腸管內壁，第7 天時模型組見造模部位腸壁出現(xiàn)嚴重炎性損傷，壞死組織色黑，附著于腸腔內表面，與周圍組織分界明顯；第14 天時局部腸段仍有增厚，壞死組織較前部分脫落，黏膜見一處或多處縱深潰瘍，結腸皺襞紊亂或消失，非藥物作用部位的黏膜肉眼觀大致正常。模型組之間比較，第7 天時，B 組和C 組造模效果相近，腸壁損傷及腸壁增厚明顯，病變范圍大；A 組炎癥范圍及程度較輕；D 組大鼠結腸肉眼未見明顯損傷。第14 天時，B組和C 組造模部位腸壁增厚仍較明顯；A 組也可見腸壁裂隙樣潰瘍，腸壁增厚程度較前兩組輕；D 組腸壁見較大范圍凹陷的潰瘍面，但腸壁增厚程度輕于B 組和C組。

對各組結腸炎大體損傷程度進行評分，結果見圖4B。模型組CMDI評分均較對照組升高，其中A組炎癥范圍、腸壁增厚程度總體較輕，D 組內大鼠病變程度差異較大，A、D 兩組與對照組相比的CMDI 評分差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組、C組造模處組織損傷及纖維化明顯，與對照組的CMDI評分差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 造模后大鼠結腸長度（A）和結腸炎大體損傷評分（B）Figure 4 The length of rat colon after model establishment(A)and colon macroscopic damage index(B) in rats after model establishment

2.5 結腸組織病理學改變

2.5.1 HE染色

光學顯微鏡下表現(xiàn)為造模部位黏膜裂隙樣潰瘍、缺損、壞死或脫落，隱窩表現(xiàn)為異常縮小、擴大或分支；炎細胞浸潤達腸壁深層，黏膜下層和漿膜層亦可見炎細胞浸潤。與正常對照組相比，模型組腸壁有不同程度增厚，以黏膜下層增厚明顯，黏膜肌層和固有肌層也可見增厚，部分切片可見管壁組織變性的血管。總體而言，A組炎癥程度較輕，B組和C組較重，D組炎癥程度輕重不一（圖5A）。

2.5.2 Masson染色

Masson 染色使膠原纖維及黏液藍染，細胞質和肌纖維紅染，細胞核呈棕黑色。對照組與模型組對比明顯。對照組藍染區(qū)域主要集中在黏膜下層，黏膜下層為疏松結締組織，生理狀態(tài)下膠原纖維含量豐富，肌層及漿膜層組織內無明顯藍染。模型組以黏膜下層、肌層彌漫性藍染和厚度增加最為明顯，部分樣本漿膜層亦出現(xiàn)類似表現(xiàn)。炎細胞浸潤和膠原沉積呈透壁性，深達腸壁各層。第7天時，A組、B組和C組黏膜下層、肌層及漿膜層增厚，組織內均出現(xiàn)彌漫性藍染的膠原沉積，其中A、B兩組黏膜下纖維化最為明顯；C組漿膜層也出現(xiàn)明顯增厚及膠原沉積；D 組與對照組無明顯差異。第14 天時，A 組標本造模部位的黏膜下層和肌層均出現(xiàn)膠原彌漫性沉積增多；B組和C組病變分別與其第7天樣本相似；D組腸壁增厚，漿膜層膠原彌漫性沉積增多，肌層纖維化嚴重，組織間分界模糊（圖5B）。

圖5 造模后大鼠結腸HE（A）和Masson（B）染色結果（×100）Figure 5 HE staining（A）and Masson staining（B）of rats’colons after model establishment(×100)

3 討論

由于腸纖維化在CD發(fā)展過程中難以預測，僅靠臨床人體研究進展困難或滯后，動物模型可以極大地補充和擴展腸纖維化在CD中的研究，具有無可替代的重要作用。腸纖維化模型有限，現(xiàn)已開發(fā)出化學誘導型、微生物型、免疫介導型、基因靶向型、自發(fā)型、輻射誘導型和手術干預型等七大類［8-9］。不同類型的疾病模型沒有絕對的優(yōu)劣和固定標準，它們具有不同的關鍵特征、潛在機制和優(yōu)缺點，允許人們從多個側面增進對疾病機制的認識并加以互補，研究人員可根據模型特點，按照病因學、免疫學、發(fā)病機制、藥物篩選等不同研究方向和用途選用恰當的模型［10-11］。

CD 的炎癥及纖維化均涉及先天和后天性免疫機制［2］。盡管目前CD 的炎癥治療已取得顯著進展，但抗感染治療不能減少纖維化，也尚無抗纖維化藥物可用［8，12］。在應用廣泛的化學誘導型模型中，TNBS因其誘導的結腸炎癥與CD 疾病特征和免疫機制具有相似性，故在CD 的免疫研究和藥物篩選上占據重要地位［13］。TNBS是一種接觸性致敏的化學性半抗原物質，與乙醇配制成溶液后使用，由乙醇破壞腸黏膜屏障完整性，繼而使TNBS得以滲入腸壁，與組織蛋白結合形成抗原后誘發(fā)免疫反應，引起結腸炎癥［13］。

以往認為，CD的腸纖維化是在相對緩慢的慢性炎癥過程中產生［3，12］。鑒于此，TNBS誘導的腸纖維化模型多為慢性模型，通過周期性重復給藥方案來建立，需在6～8周甚至更長的周期內定期反復給藥［8，14］，故成模周期長、效率低、鼠齡老化嚴重、動物死亡或產生耐受等不足限制了其應用。同時，近期研究顯示，CD的腸纖維化進程既不完全依賴于炎癥，也不一定是一個緩慢的過程［3］，CD腸纖維化和狹窄可以在短期內發(fā)生，所以急性形成的腸纖維化動物模型對病程研究也具有重要意義。本研究證實TNBS一次性造模即可導致急性腸纖維化發(fā)生，打破了TNBS難以在短期內誘導腸纖維化的以往觀點［9］。

以往文獻中有關TNBS誘導造模的操作方法通常是向大鼠或小鼠結腸內滴注一定配比的TNBS溶液并采用倒置體位保持1～3 min。但在實踐中這種方法失誤可能性較大。本課題組反復摸索實驗條件，認為成模的關鍵在于TNBS 溶液與腸壁有效接觸且作用時間充足，才能在特定的藥物配比下產生預期的效果。故本研究中采用了改良的一次性保留灌腸法，通過延長藥物的有效作用時間，不僅成功建立了纖維化明顯、成模率穩(wěn)定的急性纖維化模型，還提高了造模效率。

本研究還通過設立不同藥物配比的分組來觀察模型效果的差異。嘗試不同TNBS 溶液配比的必要性在于，TNBS的有效劑量接近動物的致死量，需要給予亞致死量的TNBS 來使結腸炎癥最大化［10，15］。造模條件不足，則出現(xiàn)成模率低、炎癥輕、自愈快、同一造模條件下組內模型間異質性大等問題；造模條件過度，則導致動物極度虛弱或死亡率升高。本實驗中4 個模型組給藥體積相同，A、B、C 組按照TNBS/乙醇為1∶1的比例使用了相同劑量的TNBS和50%、75%和100%的乙醇溶液來配制；結果顯示A、B 兩組無動物死亡，A 組總體纖維化評價較B 組輕，B、C 兩組均產生了中重度的腸纖維化，但C組有33.3%的死亡率。D組按照TNBS/乙醇為2∶1 的比例，使用了2 倍劑量的TNBS 和50%的乙醇溶液；結果顯示組內成模效果差異較大，且同樣有33.3%的死亡率。以上結果說明高劑量的TNBS和高濃度的乙醇均具有較強的致死性，而乙醇濃度過低會使破壞黏膜屏障的效果降低，導致模型不穩(wěn)定，而A、B兩組的配比在保留灌腸中使用相對安全有效。對于實際使用而言，雖然A、B兩組纖維化程度有輕重差異，但均具有應用價值：A 組造模條件適用于針對CD疾病早期、纖維化總體較輕的研究，B組適合于CD纖維化明顯的疾病中晚期研究。

纖維化的特征是富含膠原的細胞外基質，在通常含有較少結締組織的組織中過度蓄積［3］。富含膠原的細胞外基質及間質樣細胞在正常腸組織中主要存在于黏膜下層，二者在病變局部增生不僅導致黏膜下層過度纖維化，還導致黏膜肌層及固有肌層增厚，這被認為是CD 腸纖維化的組織學特征［16］。在本組模型中，造模部位出現(xiàn)肉眼可見的病變，腸段的腸壁增厚；HE染色顯示炎細胞呈彌漫性浸潤于腸壁的各層結構中；Masson 染色顯示，TNBS/乙醇誘導的腸纖維化模型的纖維化和增厚主要發(fā)生在黏膜下層和肌層，漿膜層亦可有明顯的膠原纖維彌漫性增多。Zidar 等［17］在人類CD 樣本上觀察到的結果與上述結果一致；該學者認為，CD的纖維化發(fā)病機制可能與其他器官的纖維化相當，可能是腸壁對其深層結構中存在的炎癥產生（過度）反應的結果，纖維化的部位即是間充質細胞聚集的部位。本模型模擬了CD“透壁性”炎癥和深層組織纖維化的表征，在組織病理學水平上具有應用于CD纖維化研究的參考價值。

使用TNBS 也存在一定不足，這是由于TNBS 誘導模型受多方面因素的影響。（1）動物對藥物反應的異質性：TNBS 能否誘發(fā)結腸炎首先與動物有關。TNBS可用于大鼠、小鼠和兔，不同種屬和品種品系的動物具有不同的易感性和耐藥性，病程進展和持續(xù)時間也有差異，選擇對TNBS敏感的品種品系能增加模型的成功率。常見的IBD 模型動物有SD、Wistar 大鼠和BALB/c、SJL/J、WT、C57BL/6J 小鼠［18］。需要注意的是，某些動物（如C57BL/6 小鼠）對腸道瘢痕形成抵抗力較強，可誘發(fā)炎癥但不一定能引起實質性纖維化［4，7］。（2）微生物背景：微生物在腸道炎癥模型建立和最終發(fā)生纖維化中發(fā)揮關鍵作用［3，19］，誘導和維持腸道炎癥依賴腸道菌群的存在，“無菌無結腸炎”的觀點現(xiàn)已被廣泛接受［11］。動物攜帶的微生物不同，可能使同樣的濃度方案出現(xiàn)不同輕重的炎癥。預實驗有益于個體化調整濃度和劑量方案。以上為動物實驗中不可避免的差異。（3）鼠齡：鼠齡小對TNBS敏感性較高，但由于鼠齡與體質量正相關，體質量過輕的動物對藥物耐受性較差，容易死亡。禁食24 h 的大鼠體質量在200 g以上時造模后存活率更高。（4）性別：動物模型會因性別不同出現(xiàn)差異［20］，故在同一實驗中，應使用同性別的動物。綜上，相同品種品系、來源、批次、周齡及相同的飼養(yǎng)環(huán)境能較好地控制模型條件的均質性，但即使嚴格控制了以上所有條件，仍存在出現(xiàn)造模失敗或動物死亡的可能性，所以適量計劃額外數量的動物是有必要的。

另外，TNBS 灌腸的操作技術也可能引起造模失誤，故總結下述細節(jié)以供參考。（1）麻醉前充分促排糞便。糞便會吸附藥液，影響藥物與腸壁接觸。禁食24 h 不能使糞便排空，而延長禁食時間會使大鼠體質量和耐受性進一步下降，使死亡率升高。除用棉簽刺激肛門外，也可手指沿腹中線在大鼠下腹部向肛門方向輕輕推壓助排。進管時若遇阻澀感說明腸腔仍有糞便存留。（2）充分的麻醉是順利完成保留灌腸的保障。（3）使用圓頭側開口灌腸管可避免銳器導致腸穿孔的風險。（4）避免用石蠟油潤滑灌腸管，以減少石蠟油黏附于腸壁。蘸取少量灌腸藥液即可潤滑。（5）長時間保留灌腸時，大鼠倒置懸掛不能完全避免藥液溢出。灌腸管的插入、藥液的刺激性、藥液體積、給藥速度等因素均可引起大鼠腸道反射使藥液被排出，且溢藥量難以估計。退出灌腸管后立即夾閉肛門并保持頭低體位可有效避免。有研究者嘗試在小鼠灌腸后使用肛塞［21］，但經嘗試不適用于大鼠。本實驗中使用木夾，夾閉力度適中，持續(xù)夾閉30 min 后未觀察到對大鼠肛門造成明顯損傷。（6）藥物質量是關鍵。同批次的新鮮TNBS和無水乙醇可保證模型效果，實驗中造模時間較長時需避免乙醇揮發(fā)的影響。

造模后大鼠體質量減輕、腹瀉、肉眼血便及隱血便等與腸炎程度有良好的相關性，體外觀測相關癥狀即能體現(xiàn)模型的嚴重程度和進展。造模后24 h 通過觀察體征變化判斷造模效果，再進行隨機分組，可減少模型異質性對研究結果的影響。

綜上所述，本研究建立了一種運用改良一次性保留灌腸技術建立急性腸纖維化模型的方法，該方法簡便、周期短、造模效果穩(wěn)定、腸壁纖維化表現(xiàn)明顯，動物死亡率低。而且這一方法建立的大鼠模型中腸纖維化的組織學特點與臨床上CD 腸纖維化具有相似性，因此本研究中的操作方法及藥物配比可推廣應用于該領域的相關實驗研究，具有良好的參考價值。同時，模型大鼠急性腸纖維化的分子學機制值得進一步研究探討。

［醫(yī)學倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究所涉及的所有動物實驗均已通過上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（PZSHUTCM201225008）。所有實驗過程均遵照實驗動物相關法律法規(guī)條例要求進行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Approval Letter No. PZSHUTCM201225008). All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations related to experimental animals, including the guidelines such as

Animal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018)and ARRIVE 2.0.

[作者貢獻Author Contribution]

王怡如參與課題設計、實驗操作、數據收集整理、統(tǒng)計分析、可視化處理和論文寫作與修改；蔣笑影和董若曦參與實驗操作、數據收集；潘一濱進行實驗指導、統(tǒng)計指導、論文理論部分的關鍵性修改指導；韓向暉進行實驗操作指導、論文實驗部分的關鍵性修改指導；曹永清負責課題策劃、論文修改指導及定稿。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。