利用CRISPR/Cas9 技術構建脂多糖結合蛋白基因敲除小鼠

李思迪, 付 彬, 郭中坤, 林穎杰,2, 張振宇, 米傳靚, 王可洲

(1. 山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)實驗動物學院(省實驗動物中心),濟南 250002; 2. 山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病醫院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟南 250022)

脂多糖結合蛋白（lipopolysaccaride binding protein，LBP）作為一種糖蛋白，是LBP家族成員之一［1］。LBP的相對分子質量為60 000，其蛋白質部分是相對分子質量為50 000 的單鏈多肽［2-3］。LBP 分布廣泛，在嚙齒類動物的心、肝、肺等多個器官中均有表達，其中在肝臟中的表達水平較高。人和動物血清中的LBP 主要與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 結合發揮作用［4］。LPS 又被稱為內毒素，是革蘭陰性菌外膜上的主要成分之一，可以促進炎性發生，引起機體各種疾病，嚴重時甚至會導致機體死亡［5］。研究表明，LBP與多種疾病的發生發展相關。如Heizhati 等［6］在研究LBP 對睡眠結構影響的實驗中發現，血清LBP 高濃度與中年男性高血壓患者睡眠第一階段時間延長相關；Pal 等［7］在研究與帕金森病有關的胃腸道炎性標志物時，發現LBP 是一種與LPS 神經毒性相關的胃腸道生物標志物。He等［8］在研究LPS誘導下LBP編碼基因缺失（Lbp-/-）SD大鼠的轉錄水平及其在膿毒癥期間對肝臟的影響時發現，當核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性受到抑制時，Lbp基因缺失會影響過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信號通路，從而影響細菌清除。Li等［9］研究了牛野生型LBP和突變型LBP（67Ala變Thr）對LPS 誘導牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，BMEC）炎性反應的影響，發現5 μg/mL突變型LBP處理BMEC 導致的細胞凋亡率高于野生型LBP，且沒有細胞毒性。這些相關研究揭示了LBP與LPS 結合可導致炎性反應的發生，但對其具體作用機制的研究還不夠深入。為探索LPS在Lbp基因敲除小鼠體內如何誘導炎性反應發生、發展，本文將外顯子2的全部序列與外顯子3的部分序列特異剪切，建立Lbp基因敲除小鼠模型，為進一步研究LBP 蛋白在免疫方面的作用機制和生理作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6J 小鼠和ICR 小鼠均購自北京唯尚立德生物科技有限公司［SCXK（京）2016-0009］，飼養于山東省實驗動物中心［SYXK（魯）2019-0007］，飼料購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，并經60Co滅菌。實驗動物使用遵循3R原則，且獲得山東省實驗動物中心倫理委員會批準（20181224-01）。

1.2 主要試劑與儀器

實驗所用試劑：Cas9 mRNA、Cas9/gRNA 靶點效率檢測試劑盒（VK007）購自北京唯尚立德生物科技有限公司；Hi Scribe T7 ARCA mRNA試劑盒（E2065S）購自美國New England Biolabs 公司；人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）（181223）、血促性素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）（1905152） 購自寧波第二激素廠；pClone007 Blunt Simple VECTOR Kit （OCE20601） 、 金 牌 mix（TSE101）、動物組織/細胞基因組DNA 提取試劑盒（0180331AX）均購自北京擎科生物科技有限公司；Total RNA Kit Ⅱ（R6934-02）購自美國Omega 公司；通用抗體稀釋液（U3635）購自美國Sigma公司；高效抗 體 稀 釋 液 （WA-002） 購 自 美 國 Invent Biotechnologies 公司；高效RIPA 組織/細胞快速裂解液（R0010）購自北京索萊寶科技有限公司；一抗β-actin（4970S）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 標 記 的 抗 兔IgG 二 抗（7074S） 均 購 自Cell Signaling Technology 公司；一抗LBP（PA5-79586）購自美國Invitrogen公司。

實驗所用儀器：拉針儀（PN-31） 購自日本Narishige 公司；高速冷凍離心機（5424R）購自德國Eppendorf 公司；凝膠成像儀（Universal HoodⅡ）購自美國Bio-Rad公司；體視顯微鏡（SMZ745T）購自日本Nikon 公司；PCR 儀（Mastercycler X50s） 購自德國Eppendorf 公司；顯微注射用顯微鏡（IX73P1F）購自日本Olympus 公司；電泳儀（PowerPac?Basic）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 Lbp基因sgRNA靶點設計及制備

根據數據NCBI-Gene ID：16803及Ensembl-Gene：LbpENSMUSG00000016024 可得Lbp基因的序列結構、保守區域及轉錄產物等信息，依據這些信息設計小向導RNA（small guide RNA，sgRNA）的靶點。對Lbp基因的序列進行分析后，本實驗選擇剪切2 號外顯子全部序列及3 號外顯子部分序列，圖1 為靶點剪切示意圖。靶點設計完成后進行體外轉錄，并檢測轉錄產物活性，篩選出酶切活性較高的sgRNA 靶點備用。同時參照Hi Scribe T7 ARCA mRNA 試劑盒說明書制備Cas9 mRNA。

圖1 Lbp基因敲除示意圖Figure 1 Lbp gene knockout diagram

1.4 胚胎移植及其前期準備

準備4 周齡C57BL/6J 雌鼠和8～12 周齡C57BL/6J雄鼠。雌鼠腹腔注射PMSG 0.1 mL（5 U）/只，48 h 后腹腔注射hCG 0.1 mL（5U）/只，18 h 后取卵子備用。取雄鼠附睪，再從附睪中取出精子。

取出的精子在獲能液中獲能后，選取活力較好的精子滴加到經過短暫培養的卵細胞中，經3～4 h 體外受精獲得受精卵。用RNA-free 水配制sgRNA&Cas9 mRNA 混合物（sgRNA 25 ng/μL，Cas9 mRNA 50 ng/μL），借助顯微注射系統將其注射到受精卵內。將注射sgRNA&Cas9 mRNA 混合物的受精卵移植到經12.5 mg/mL 三溴乙醇腹腔注射麻醉后的假孕ICR 雌鼠輸卵管中，將代孕ICR 雌鼠置于獨立通氣籠盒（individual ventilated cages，IVC）中飼養，待小鼠出生后鑒定基因型。

1.5 Lbp基因敲除小鼠的獲得及鑒定

將代孕ICR雌鼠生產的仔鼠作為Founder并命名為F0代，F0代出生2 周后，剪小鼠的腳趾進行編號，使用基因組提取試劑盒提取小鼠基因組。使用正向引物（F： CATTTGTTTGGGAACCCC） 和 反 向 引 物（R：AAGGGCTGGAATGCTAATG）進行PCR 擴增。PCR 反應體系：TSE101 mix 15 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、DNA 1.2 μL、ddH2O 2.6 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；98 ℃變性20 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共35個循環；68 ℃延伸10 min；10 ℃保持。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶切膠回收進行平末端克隆、轉化、涂板，并挑單克隆測序驗證。結合基因組鑒定和測序結果：只出現770 bp 左右的目的條帶，且測序顯示單鏈缺失1 457 bp 的判斷為Lbp-/-；只出現2 153 bp 左右的野生型（wild type，WT）條帶，且測序顯示與WT一致的判斷為Lbp+/+；出現770 bp 左右的目的條帶及2 153 bp 左右的WT 條帶，且770 bp 左右目的條帶測序顯示單鏈缺失1 457 bp的 判 斷 為Lbp+/-。 F0 代 后 新 增 引 物 WT-R（TGCCTGACCCAAGAGGTTT），對引物F/R基因鑒定結果進一步驗證：F/WT-R出現810 bp左右的WT條帶的為Lbp+/+或Lbp+/-，未出現任何條帶的為Lbp-/-。F0 代小鼠進行基因組鑒定測序后，選出Lbp+/-小鼠與WT 小鼠交配，生產的后代為F1代；F1代小鼠基因組鑒定測序后，選出Lbp+/-小鼠自交，生產的后代為F2 代；F2 代小鼠基因組鑒定及測序后，選出Lbp+/-小鼠自交，生產的后代為F3 代；F3 代小鼠繼續進行基因組鑒定及測序。

1.6 RT-PCR 測序鑒定Lbp 基因敲除小鼠的mRNA轉錄

使用Total RNA Kit Ⅱ試劑盒提取組織總RNA，將總RNA 反轉錄為cDNA， 使用正向引物（F：TGCTCTCTACATTGCTGGGG） 和 反 向 引 物 （R：GGAGGTCCACTGAAATGGTG） 進行PCR 擴增。PCR反應體系：TSE101 mix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3.2 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環；72 ℃延伸5 min；10 ℃保持。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶切膠回收后進行平末端克隆、轉化、涂板、挑單克隆測序驗證。結合PCR 結果和測序結果：只出現121 bp 左右目的條帶，且測序顯示單鏈缺失244 bp 的判斷為Lbp-/-；只出現365 bp左右WT條帶，且測序顯示與WT一致的判斷為Lbp+/+；出現121 bp 左右目的條帶及365 bp 左右WT 條帶，且121 bp 左右目的條帶測序顯示單鏈缺失244 bp的判斷為Lbp+/-。

1.7 蛋白質印跡法檢測Lbp 基因敲除小鼠的LBP蛋白表達

因NCBI 及MGI 數據提示LBP 在肝臟中表達量較高，故本實驗選取肝臟組織蛋白進行蛋白質印跡實驗。取WT 小鼠、Lbp敲除雜合子鼠（Lbp+/-）及Lbp敲除純合子鼠（Lbp-/-）的肝臟組織，加入預冷的蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑，組織破碎后冰上反應30 min，4 ℃14 000×g離心5 min，取上清液并用改良型Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。然后加5×蛋白Loading 于100 ℃煮沸10 min，用5%的濃縮膠與8%的分離膠分離蛋白，0.2 A、1.5 V 轉膜50 min，5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，用預冷的TBST 洗3 次（每次10 min），加入一抗（β-actin 及兔抗小鼠LBP 抗體均1∶1 000 稀釋）且4 ℃孵育過夜，第二天用預冷的TBST洗3次（每次10 min），加入二抗（HRP標記的抗兔β-actin IgG 以1∶2 000 稀釋，HRP 標記的抗兔LBP IgG 以1∶10 000 稀釋）且37 ℃孵育2 h，用預冷的TBST 洗3次（每次10 min），Immobilon Western 化學發光HRP底物（ECL發光試劑）顯色后凝膠成像儀成像。

2 結果

2.1 根據Lbp 基因組結構設計CRISPR/gRNA靶點

通過NCBI 及Ensembl 網站查詢可知，Lbp基因有5個轉錄產物，其中3 個可翻譯為蛋白質。對該基因蛋白功能保守區域及基因序列相關信息分析發現，2、3號兩個公共外顯子位于功能保守區BPI/LBP/CETP N 端區，剪切位點位于42～123 aa 處，其蛋白編碼區的堿基數為244，非3的倍數，剪切后造成移碼突變，從而導致蛋白失活。最終我們選擇Lbp-201 作為敲除轉錄模板。在2號外顯子一端與3號外顯子中間部位設計靶點，靶點序列信息如表1 所示。針對上述設計的多個sgRNA 靶點，使用sgRNA 體外酶切活性檢測試劑盒檢測其體外酶切活性，根據靶點活性檢測結果，本實驗選擇Lbp-L4和Lbp-R1作為首選靶點。

表1 針對Lbp基因的sgRNA靶點名稱及序列Table 1 Namesandsequencesoflipopolysaccaridebinding protein(Lbp)gene-small guide RNA(gRNA)target

2.2 Lbp基因敲除鼠的鑒定

顯微注射后，共獲得65 枚生長活性較好的受精卵，將這些受精卵移植到2只假孕的ICR雌鼠中，分娩后共獲得17只F0代小鼠，基因組鑒定及測序顯示腳趾編號為3、8、10、12、15的小鼠為陽性雜合子鼠（圖2A、B），陽性率為22.73%。因F0代3號小鼠770 bp左右目的條帶較為清晰，測序顯示單鏈缺失1 457 bp，故將F0 代3 號小鼠與WT 的C57BL/6 小鼠交配，共獲得6只F1代，基因組鑒定及測序表明3只小鼠為Lbp+/-。

圖2 F0代及F2代Lbp基因敲除小鼠的基因型鑒定結果Figure 2 Genotyping results of F0 and F2 lipopolysaccaride binding protein（Lbp）gene knockout mice

F1 代Lbp+/-鼠間自交共獲得12 只F2 代鼠，基因組鑒定及測序表明4 只小鼠為Lbp-/-，5 只為Lbp+/-，3 只為WT。F3 代共獲得122 只小鼠，其中Lbp-/-30 只（14♀+16♂）、Lbp+/-61 只（32♀+29♂）、WT 31 只（14♀+17♂），分別占F3 代總數的24.59%、50.00%和25.41%，約為1∶2∶1，符合孟德爾遺傳定律且性別比例約為1∶1。

2.3 F2代Lbp基因敲除鼠的mRNA和蛋白鑒定

由Lbp-/-小鼠肝臟組織中mRNA 的RT-PCR 測序結果可知，Lbp-/-mRNA 缺失244 bp，符合設計目的（圖3A、B）。序列剪切后mRNA 發生移碼突變，拼接成新的mRNA，新序列在剪切位點后第29位（圖4B劃框位置）對應LBP 的第71 位氨基酸處引入翻譯終止信號，導致翻譯提前終止，從而無法進行正常翻譯。

蛋白質印跡實驗結果如圖3C 所示，提示Lbp-/-小鼠肝臟不表達LBP。

圖3 RT-PCR測序和蛋白質印跡法分別檢測Lbp基因敲除鼠的mRNA轉錄及蛋白表達情況Figure 3 The expression of mRNA and protein in liver tissues of Lbp gene knockout mice detected by RT-PCR sequencing and Western blotting

2.4 Lbp基因敲除鼠的表型分析

觀察F0、F1、F2、F3 代Lbp-/-、Lbp+/-小鼠的表型發現，與WT相比，其體質量、毛色、窩產仔鼠數量、對外界刺激的反應大小、自發活動等均無明顯差異。后續腹腔注射不同劑量（10、20、50、100、150 μL）、質量濃度為1 mg/mL 的LPS，觀察不同時間段Lbp-/-、Lbp+/-及WT小鼠的表型，發現WT小鼠隨注射劑量的增加，冷顫、發抖、腹瀉、眼分泌黏液、行動遲緩等癥狀加重，甚至出現死亡的現象（150 μL 劑量84 h 死亡）；相同條件下Lbp-/-小鼠的癥狀明顯輕于WT 和Lbp+/-小鼠，且沒有出現死亡現象。

3 討論

LPS 作為一種促炎因子及免疫分子，可以刺激機體發生相應的免疫反應，在天然免疫反應中發揮著重要的作用。但過高的LPS 會對機體產生不同程度的傷害，導致機體炎性因子過度釋放，嚴重時可引起多器官功能衰竭、敗血癥休克等，危及生命［10-11］。LBP的作用主要與炎性反應有關，其在發揮作用時對炎性反應有兩方面的影響［12-13］：一是當LPS與LBP 的炎性位點結合時，引起相關轉錄因子及炎性介質產生，從而起到促炎作用；二是當LPS 結合LBP 的抗炎部位時，它向靶細胞傳遞信號，中和或消除LPS，阻止LPS發揮作用，從而起到抗炎作用［14］。Lbp-/-小鼠在多種實驗研究中均有重要作用，如：Won等［15］以BALB/cLbp-/-小鼠為背景，討論了低炎性反應下與骨關節炎相關的致病介質；Molinaro 等［16］以MyD88 敲除小鼠為背景，探討了LBP 的表達對小鼠葡萄糖穩態的影響；宋子晨［17］將SD 大鼠的Lbp基因敲除，研究了LPS 對肝臟線粒體的損害及作用機制。然而，在LBP 這些相關研究中，以C57BL/6JLbp-/-小鼠為背景的相關報告較少。LBP 與LPS 結合的具體作用機制雖有研究，但造成炎性反應的因素較為復雜，LBP 在抗菌、抗炎等方面的作用機制需要進一步揭示［18-20］。

Lbp基因有5 個轉錄產物，其中Lbp-201、Lbp-202、Lbp-203 可翻譯為蛋白質，Lbp-202 的序列為1～123 aa，Lbp-203 的序列起始位點為194 aa。本次實驗在設計靶點時考慮到這3 個序列的差異，因此選擇對Lbp-201的序列進行剪切，剪切位點位于功能保守區的N 端（42～123 aa），剪切后導致Lbp-201、Lbp-202、Lbp-203 均無法正常翻譯，從而達到LBP 失活的目的。本次實驗利用CRISPR/Cas9技術構建Lbp敲除小鼠，通過PCR 鑒定及測序驗證，F0 代共獲得5 只Lbp+/-小鼠，F1 代3 只Lbp+/-，F2 代4 只Lbp-/-、5 只Lbp+/-，F3 代30只Lbp-/-、61 只Lbp+/-。F2 代Lbp-/-DNA 測序結果顯示，1 457 bp 缺失符合預期，其RNA 測序結果顯示244 bp缺失符合預期。

蛋白質印跡實驗結果表明，Lbp-/-小鼠肝臟中LBP不表達，F3代各小鼠基因型和性別數值顯示，本次構建獲得的Lbp敲除小鼠能夠穩定遺傳，且符合孟德爾遺傳規律。雜合子小鼠繼續繁育，即可獲得大量可用于后續實驗的純合子敲除鼠。正常情況下Lbp-/-的表型與WT 沒有顯著差異，但注射LPS 后WT 小鼠的炎性反應顯著大于Lbp-/-，由此猜測Lbp-/-雖無法正常表達LBP，但仍會將LPS信號傳遞給靶細胞，引起機體出現冷顫、發抖等炎性反應，但是此傳遞過程緩慢，引起的炎性反應程度輕。

綜上，本實驗利用CRISPR/Cas9 技術成功構建了以C57BL/6J為背景的Lbp-/-小鼠，為進一步探索LBP對C57BL/6J 小鼠腸道菌群的影響，研究LBP 缺失前后LPS對肝、腎等組織免疫調節的影響提供了基礎。

[醫學倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究中動物實驗遵循3R 原則，已獲得山東省實驗動物中心倫理批準（20181224-01）。所有實驗過程均遵照實驗動物相關法律法規條例要求進行。

The animal experiments involved in this study were carried out in accordance with the principle of 3Rs, and had obtained the ethical approval of Shandong Laboratory Animal Center (No. 20181224-01). All experiment protocols were carried out following the relevant laws and regulations on Laboratory animals.

[作者貢獻Author Contribution]

李思迪負責論文撰寫及實驗實施；付彬、郭中坤負責論文撰寫及實驗實施指導；林穎杰負責論文實驗操作指導；張振宇、米傳靚負責論文相關實驗操作；王可洲負責實驗實施指導、論文撰寫及修改指導。

[利益聲明Declaration of Interest]

本文所有作者均聲明本文不存在利益沖突。