淺談微量采血法在藥物非臨床研究中的應用及3R原則的貫徹

陳佳琦, 呂龍寶, 張飛燕, 李 瑞, 李乙江, 李麗紅, 張曉迪

(中國科學院昆明動物研究所,昆明 650223)

藥物臨床前的評價研究離不開實驗動物的條件技術支撐。為探究藥物的有效性和安全性，為人類臨床試驗提供參考，需要開展各種體內外實驗，包括藥效學（pharmacodynamics）、藥代動力學（pharmacokinetics）和毒代動力學（toxicokinetic）等評價研究。作為動物離體器官、組織、細胞的“捐獻者”，以身試病、以身試藥、以身試毒的“受難者”，實驗動物為人類及動物的健康作出了巨大貢獻和犧牲。隨著科學技術的發展與社會文明的進步，如何處理動物實驗引發的倫理學問題，已成為藥物研發中的一個重要課題。

以替代（replacement）、優化（refinement）和減少（reduction）為核心的3R原則為緩和與化解實驗動物倫理矛盾提供了一種可行的解決理論。3R原則是現代科學研究中使用動物的基本原則［1］。世界范圍內，已有上百個國家制定了實驗動物福利相關的法律法規及標準，這些法律及標準的核心均是3R原則。歐盟2010年頒布的《保護實驗動物2010/63/EU 號指令》也明確了3R原則的指導性地位［2］。我國修訂中的《實驗動物管理條例》《關于善待實驗動物的指導性意見》《實驗動物福利倫理審查指南》等法規及標準中也明確了3R原則。因此，3R原則是實驗動物福利倫理的核心體現。

生物分析技術的進步，開啟了微量血樣分析的時代，也帶動了微量采血法的發展。微量采血法是指血液樣本不超過50 μL［3］的采集程序。該技術最大的特征是樣品體積的微小化，例如利用Gyrolab免疫實驗平臺，血液樣本的體積可縮小至4 μL［4］。在藥物非臨床研究中應用微量采血法，被認為是貫徹3R原則的重要實踐，得到了國際人用藥品注冊技術協調會（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的認可［5］。因此，本文聚焦于藥物非臨床研究領域，介紹了微量采血法的最新研究進展以及應用的優勢和挑戰，以期推動該技術更廣泛的應用，促進藥物研發與動物福利倫理的協調發展。

1 不同微量采血法的最新進展

非臨床研究中，有幾種常用的微量采血法。實際應用過程中，方法的選擇應考慮到每種方法的適用條件和特點（表1）。

表1 非臨床研究中幾種常見的微量采血法Table 1 Common approaches for blood microsampling in non-clinical studies

1.1 干血斑（dried blood spot，DBS）

DBS，即將約15 μL 的全血樣品直接滴到卡紙上，樣品在常溫干燥后，通過使用打孔器獲得相同尺寸的濾紙片，用于樣品的提取和分析。DBS 因具有微創、簡單、易于存儲和運輸等優點，五十多年來一直是臨床上新生兒遺傳代謝性疾病篩查的常用采血方法。2004 年，Beaudette 和Bateman［6］將DBS 引入到非臨床研究中，并證明了其在藥物發現階段的潛力后，DBS技術迅速推廣。Clark 等［7］開發了一套高靈敏度的通用性分析方法，可使90%測試化合物的定量下限為1 ng/mL，并將其應用于小鼠藥代動力學研究，得到了更高質量的藥代動力學特征。Barfield 等［8］將DBS 首次用于非臨床安全性評價研究，觀察到從犬血DBS 樣品中獲得的乙酰氨基酚毒代動力學特征與液態基質血樣的相當。

近來，研究人員對DBS 的研究熱情因其在臨床應用中暴露出來的生物分析問題而有所降低。DBS 的生物分析問題均與基質為全血有關。具體來說，血細胞比容（hematocrit，HCT）會影響斑點的大小［9］和目標分析物的提取，進而在定量生物分析中引入系統誤差［10］。這對于遺傳均一性良好的實驗動物來說，可能并不是太大的問題，但在開發紅細胞增多癥、貧血、癌癥等疾病的藥物時，應特別關注。業界在過去幾年內也提出了幾種解決方案：一是通過基于鉀離子濃度或血紅蛋白濃度［11］來估計和校準DBS樣品中的HCT；二是改變濾紙材料，如采用疏水紙，減少血紙互作［12］；三是通過濾紙片預打孔［13］或濾紙片周圍增設濾紙環［14］，配備“計量芯片”［15］等技術收集和存儲準確體積的血液。這些技術的改進，大大促進了DBS的應用和發展。

1.2 干血漿斑（dried plasma spot，DPS）

DPS 與DBS 相似，唯一不同的是滴在卡紙上的是血漿樣品。DPS 保留了DBS 的許多優點（穩定性好，保存和運輸方便），同時解決了DBS最大的問題（HCT效應）。缺點是血液需要離心處理，且所需血量要加倍。在一項以犬為模型的研究中，Li 等［16］分析了不同方法（通過移液器或SAFE-TEC）制備的DPS 樣品中利托那韋的濃度，結果顯示與液態血漿中的藥物濃度一致，試驗樣品再分析（incurred sample reanalysis）的結果也表明DPS 技術可穩定檢測。之后，Li 等［17］的對比研究顯示從大鼠尾靜脈連續采血制備DPS 樣品或液態血漿中多乙酰氨基酚及其代謝產物對乙酰氨基酚葡糖苷酸（APAP-gluc）和對乙酰氨基酚硫酸結合物（APAP-sulf）的濃度，與從舌下靜脈采集的血漿中濃度不相上下，且連續收集毒代動力學樣品并未增加動物的應激水平，從而證明了DPS 在大鼠毒代動力學研究中的實用性。

相較于其他微量采血技術，DPS 在非臨床研究中的應用很少，可能與干燥基質的驗證負擔以及復雜的操作程序有關。該技術最新的改進主要是提高了操作和分析的自動化水平，包括在DBS 的基礎上增加紅細胞過濾膜［18-20］以簡化采樣程序，引入微流體過濾和自動計量技術［21］以快速獲得準確體積的血漿，以及開發與現有DBS機器人技術兼容的DPS卡［19-20］。

1.3 固定體積采血法（volumetric absorptive microsampling，VAMS）

VAMS 是采樣設備的吸頭不完全浸入全血、血漿或血清中，通過毛細作用準確收集特定體積血樣的方法。干燥后，血樣被運送到生物分析實驗室進行處理。VAMS 也是DBS 的一個改進版，幾乎擁有DBS 的全部優點，且不用考慮HCT的影響［22-23］，操作更方便，更適合自動化處理。經多項方法驗證，已有文獻報告證明了VAMS 應用于非臨床研究的可行性［24-26］。VAMS的首次實際應用是Denniff 等［27］對乙酰氨基酚的大鼠毒代動力學研究。這項研究中，VAMS 樣品和液態稀釋血樣表征的藥-時曲線下面積很接近，但藥峰濃度之間出現了40%的差異，差異的原因可能與樣本量小有關，而與采血方法無關。Thiry 等［28］通過優化生物分析方法，將VAMS成功應用于4種伊曲康唑制劑的生物利用率的評估實驗中。

值得一提的是，雖然VAMS 在基質選擇上比DBS更為靈活，但選擇全血為基質時同樣面臨需要關聯全血濃度和血漿濃度的問題，選擇其他基質類型，需要利用其他設備來制備血漿或血清，操作較為復雜。

1.4 毛細管微量采血法（capillarymicrosampling，CMS）

CMS 是指用毛細管準確收集固定體積全血、血漿或血清的方法。典型的過程是將毛細管的一端浸入血液中，通過毛細作用準確收集全血，完成后可直接進行低溫保存，也可進行稀釋、分離血漿或血清等預處理。CMS 被視為最有潛力的微量采血法，因為它除了樣品量的減少外，與常規采樣并沒有本質區別［29-31］。基質的形式未發生改變，避免了進行“干基”和“濕基”之間的橋連研究，且CMS 多用于制備應用最廣泛的血漿樣品，不需要全血和血漿數據之間建立聯系的復雜過程。與普通DBS 相比，CMS 所采樣品體積更準確［30］，與基質的生理特性（如HCT）無關。受DBS的啟發，人們很快將CMS 應用到非臨床研究中，評估了小鼠、大鼠和犬等物種的藥代動力學、毒代動力學參數，結果證明該技術給出的結果與常規方法有高度可比性［31-36］。

CMS 的缺點是操作復雜，分離血漿或血清時需要切割毛細管，存在扎傷風險。不過有研究者提出了一種帶觸變性凝膠（離心時在血細胞和血漿間形成物理屏障）的毛細管［37］，這種改良的毛細管省去了切割步驟，提高了操作的便利性和安全性。

2 微量采血法的應用優勢

2.1 動物福利方面

微量采血法有助于3R原則中“優化”的實現。由于所需血量很少，根據實驗性質可選擇動物的疼痛、組織損傷及壓力最小且操作更簡單的采血部位和程序。常用的采血部位通常是大鼠、小鼠的側尾靜脈、隱靜脈，兔的耳緣靜脈，犬、猴的頭靜脈。對于嚙齒類動物和兔來說，可大幅縮短采血前通過加熱或施加化學刺激物等措施促進血管擴張的時間［38］。對于所有動物而言，采血過程中不需要或僅需要很小程度的身體限制，保證了人員安全，避免了動物應激。在Powles-Glover等［38］的研究中，高達62%的大鼠在未進行任何身體限制的情況下被成功實施了微量采血法。常用的采血針規格為23 G，故對動物身體的損傷極小［39］。另外，由于操作簡單方便，采樣程序可直接在動物設施中進行。

除了“優化”，微量采血法也有利于“減少”的實現。非臨床研究中，對動物數量影響最大的是藥代動力學和毒代動力學研究。常規嚙齒類動物的藥代動力學研究設計，一般在24 h 內設6～12 個采血時間點，每個時間點每個組至少3 只動物，以充分解析藥物的動力學性質。由于血容量和采樣部位等［40］的限制，每個組需要24～36 只小鼠或者6～9 只大鼠［41-42］。毒代動力學與藥代動力學類似，但是給藥劑量更高。常規嚙齒類動物的安全性評價中，為避免干擾毒理學終點，毒代動力學樣本是由主要研究動物之外的衛星動物提供的，這使得動物用量更大。微量采血法結合靈敏的生物分析技術，使血樣體積微小化，允許在特定時間內對同一動物同一位點進行多次采樣，因此可以大幅減少動物的用量。據報告，與傳統采樣相比，微量采血法可減少66%～95%［28，43-50］的動物用量，當然具體減少幅度取決于研究類型、物種、采血方案等因素。

2.2 科學方面

微量采血法允許重新設計非臨床研究方案，以更少的動物獲得足夠多的優質數據，提高了研究的轉化價值。“多”體現在檢測指標、藥-時曲線數量的增加［48］，以及可獲得常規方法難以采集的信息，實現信息的最大化。“優質”來源于兩個方面：一是不易造成動物過度的應激反應，對藥代動力學或毒代動力學參數的干擾較小，這在肝提取率較高的藥物研發中尤為重要；二是對于嚙齒類動物，同一個體的藥理學或毒理學效應可直接與藥物暴露關聯，而且每只嚙齒類動物都可能擁有完整的藥代動力學/毒代動力學特征，個體間的變異系數降低了。Joyce 等［47］研究了微量采血法所得藥代動力學參數的個體間變異系數，結果顯示傳統采血的高達150%，而微量采血法的不超過30%。

2.3 成本方面

微量采血法可有效節約成本。隨著動物用量減少，藥物、動物、實驗用品和實驗人員等直接成本大幅下降，尤其在藥物量十分有限的發現階段和利用昂貴的轉基因小鼠［34，47］開展的研究中。另一方面，以較低的成本獲得充足的優質數據，意味著可以用少量的資源開展實驗，從而快速做出決策，這對藥物發現項目都相當有利。例如，在藥物發現階段早期，篩選具有合適的生物利用率的化合物，可采用連續微量采血法將6 種化合物的藥代動力學研究同時進行，這樣的動物用量可減少80%，藥物材料可減少75%，研究時間減少40%［47］。當然，成本的節約程度取決于具體的研究類型、物種、采血方案等［51］。

3 微量采血法的應用挑戰

目前，微量采血法的發展面臨著兩個挑戰。一是提升檢測微小體積樣本中目標分析物的能力。樣品體積的減少，制備和運輸方式等的改變，可能會給檢測的準確度和靈敏度造成不利影響。絕大多數目標分析物與高靈敏度的分析方法（液相色譜－質譜聯用法LC-MS/MS 和Gyrolab 免疫實驗平臺）兼容，可使用10 μL或更少的樣品就達到足夠的靈敏度，而對于藥物為肽類和核酸類等具有特殊分子結構和性質的物質，可能還需要開發靈敏度更高的生物分析方法。二是毒理學解釋的能力。嚙齒類動物的非臨床安全性評價中，收集毒代動力學血樣可能會對主要研究動物的器官功能和臨床病理參數產生影響。有研究人員對此進行了調查，結果表明：在正常及某些特殊生理狀態（如妊娠）的嚙齒類動物上實施微量采血法，對毒理學評價終點的影響是微乎其微的［32，37，43-45，52-53］。當然，為支持微量采血法的更廣泛應用，還需要繼續開展相關的配套研究，如針對具有特殊分子結構和性質的物質，開發靈敏度更高的生物分析方法，進一步探索各種毒性研究中對主要研究動物實施微量采血法收集毒代動力學樣本的影響等。

4 小結

在藥物非臨床研究中，微量采血法能提高動物福利，減少動物的用量，獲得足夠、優質數據，降低研發成本，是值得推廣的一項新技術。但是，未來還需要繼續開展該方法及其相關的配套研究，以促進其更廣泛的應用，實現科學進步與動物福利倫理進步并行。

[作者貢獻Author Contribution]

陳佳琦負責文獻查閱和整理，以及文章撰寫與修改；呂龍寶負責文獻查閱和整理，并對文章撰寫提供指導，以及對全文進行修改；張飛燕參與文章思路及整體內容的討論和全文修改；李瑞負責臨床前研究和生物分析相關知識的討論和梳理；李乙江、李麗紅：提供文章整體內容的修改建議；張曉迪參與文章思路及整體內容的討論。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。