皮膚致敏性替代試驗方法的研究進展

黃靜怡, 李培寧, 劉香梅, 劉忠華, 黃宇鋒

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510630; 2. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,廣州 511447)

過敏性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD） 是由低分子量化合物（low molecular weight，LMW）與存在于皮膚中的內(nèi)源蛋白結(jié)合形成的Ⅳ型超敏反應(yīng)。ACD 的臨床癥狀通常表現(xiàn)為皮膚瘙癢、紅斑及丘疹等。LMW普遍存在于化學(xué)品、藥品以及個人護理用品中，LMW與皮膚的頻繁接觸會導(dǎo)致ACD發(fā)病率增加。研究表明，在歐洲特定人群中，ACD 的患病率高達18.6%，占西方世界工作人口中所有職業(yè)性皮膚病的85%～90%［1］。因此，ACD 已經(jīng)成為一種職業(yè)性皮膚病，在一定程度上影響了人類的正常生活和工作。

傳統(tǒng)的皮膚致敏性測試通常采用的是動物實驗，譬如豚鼠最大值試驗（guinea pig maximization test，GPMT）、Buehler 封 閉 斑 貼 試 驗（Buehler test，BT）等。然而，隨著近年來毒理檢測技術(shù)的進步、研究方法的更新、動物倫理被越來越多的國家重視和關(guān)注，皮膚致敏性測試替代方法的開發(fā)就顯得尤為重要。因此，本文結(jié)合國內(nèi)外研究進展，就體內(nèi)替代致敏方法、基于有害結(jié)局通路（adverse outcome pathway，AOP）機制的體外替代方法以及基因組過敏原快速檢測法（genomic allergen rapid detection，GARD）等目前幾類皮膚致敏性測試替代方法進行綜述。

1 體內(nèi)替代方法

皮膚致敏體內(nèi)替代方法是指使用小鼠替代豚鼠作為實驗動物主體，建立小鼠局部淋巴結(jié)測試法（local lymph note assay，LLNA）。根據(jù)LLNA 法的優(yōu)點和局限性，研究人員開發(fā)了基于LLNA 法的改良方法，即5-溴 脫 氧 尿 嘧 啶 核 苷 （5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）-酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）-LLNA 法和LLNA-內(nèi)源性三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測法。

1.1 基礎(chǔ)的LLNA法

LLNA是鑒別化學(xué)物質(zhì)是否具有致敏潛力的替代測試方法之一，已被歐盟67/548/EEC 指令認可。LLNA是以致敏物能誘導(dǎo)皮膚接觸部位引流淋巴結(jié)中的T 細胞活化增殖為基礎(chǔ)，將被放射性物質(zhì)標記的核酸（如3H-甲基胸腺嘧啶脫氧核苷、125I-碘脫氧尿嘧啶核苷等）由尾靜脈注入小鼠體內(nèi)［2］，5 h后取誘導(dǎo)部位淋巴結(jié)制備單細胞懸液，測定T細胞增殖情況。

該方法的檢測指標有兩個。一是刺激指數(shù)（stimulation index，SI），即受試組與對照組增殖T細胞的比值，該指標用于判斷受試物是否為致敏劑。當SI≥3 時，受試物被判定為致敏劑［3］。另一個檢測指標是SI=3時的有效化學(xué)品濃度（effective chemical 3，EC3），該值可以通過劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)的線性差值得出［4］，用于受試物的致敏能力分級。根據(jù)歐洲化學(xué)品生態(tài)毒理學(xué)和毒理學(xué)中心公布的數(shù)據(jù)，當EC3＜0.1%時，受試物判定為極強致敏劑；當EC3在0.1%～1%時，受試物為強致敏劑；EC3在1%～10%時，受試物為中度致敏劑；EC≥10%，則為弱致敏劑［5］。

LLNA法具有周期短、實驗動物使用量少、判定方法更為客觀準確等優(yōu)點，同時不需用弗氏佐劑來刺激受 試 動 物， 符 合 3R （reduction、 repIacement、refinement）原則。LLNA 法已于2010 年被世界經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）納入皮膚致敏檢測方法指南［6］。值得一提的是，LLNA 法易被受試物的溶解性所限制。因水溶性大分子物質(zhì)很難在小鼠的皮膚上涂抹均勻并被吸收［7］，因此該方法只適用于脂溶性的小分子物質(zhì)。

1.2 已通過驗證的LLNA改良法

1.2.1 BrdU-ELISA-LLNA法

2003 年，Takeyoshi 等［8］利用示蹤劑代替放射性標志物建立了LLNA 的改良方法，即BrdU-ELISALLNA（又稱LLNA：BrdU-ELISA）。其在原理和檢測指標方面，與LLNA 法基本一致，但在核酸標志物方面改用與胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)相似的BrdU。即在末次染毒24 h 后腹腔注射BrdU，處死小鼠取淋巴結(jié)，稱重后制備細胞懸液，然后采用ELISA 法檢測增殖細胞中BrdU的標記數(shù)。

該方法綜合了LLNA 試驗周期短、動物用量少、判定方法客觀的優(yōu)點，還解決了LLNA 法使用放射性標記物的安全性問題。在OECD 指南中，該方法推薦使用CBA 小鼠，但這種品系的小鼠在我國供應(yīng)數(shù)量較少，且價格偏貴。因此，有學(xué)者通過對比分析BALB/c和CBA 兩種品系小鼠用該方法試驗的結(jié)果，證實可以使用BALB/c 小鼠替代CBA 小鼠進行LLNA：BrdUELISA法檢測［9］。除此之外，該法腹腔注射BrdU時會使小鼠痛苦，不符合動物福利。基于此，有研究團隊改進了LLNA：BrdU-ELISA 法，先給小鼠耳部染毒后處死，取耳后引流淋巴結(jié)，在含有BrdU的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)淋巴細胞24 h后，再對淋巴細胞中的BrdU含量進行測定［10］。

1.2.2 LLNA-ATP檢測法

LLNA-ATP 檢測法（又稱LLNA：DA） 是基于ATP水平與活細胞數(shù)呈正相關(guān)，并且可與熒光素-熒光素酶復(fù)合物作用產(chǎn)生可測定光這一原理，因此可以通過生物熒光法檢測細胞中ATP 的含量來確定受試物的致敏性［11］。該法選用的測試指標包括ATP發(fā)光值、淋巴結(jié)質(zhì)量、增殖的淋巴細胞數(shù)，以及SI和EC值［12］。

該方法具有LLNA：BrdU-ELISA 法的全部優(yōu)點，但因?qū)TP 數(shù)量作為測試指標，有著明顯的局限性。（1）時間限制：動物死后體內(nèi)ATP 數(shù)量會逐漸下降，若長時間不進行測定，測試結(jié)果會出現(xiàn)偏差。因此，OECD 指南明確規(guī)定待測樣本從取材到檢測的時間應(yīng)在20 min以內(nèi)［13］。（2）假陽性：為解決這個問題，有研究人員提出，可以同時開展耳重、耳厚差等活組織檢測以及紅斑評級，以排除受試物的刺激性對結(jié)果的影響［14］。（3）該法不適用于影響ATP生成和穩(wěn)定性的受試物，例如ATP抑制劑等［14］。

2 基于AOP的體外替代方法

2007 年，由美國國家科學(xué)研究委員會首次提出AOP，用以描述皮膚敏化從分子起始事件到系統(tǒng)敏化效應(yīng)產(chǎn)生過程中的一系列反應(yīng)事件。2012 年，OECD提出將皮膚變態(tài)反應(yīng)的體外研究方法整合，建立基于AOP原理的皮膚致敏預(yù)測方法［15-16］，包括直接反應(yīng)肽試驗（direct peptide reactivity assay，DPRA）、氨基酸衍生物反應(yīng)性測定（amino acid derivative reactivity assay，ADRA）、KeratinoSensTM/LuSens試驗和人細胞系活化試驗（human cell line activation test，h-CLAT）。

皮膚致敏AOP 機制由4 個要素組成：（1）起始事件（molecular initiating event，MIE）是抗原和皮膚蛋白結(jié)合形成免疫復(fù)合物半抗原；（2）角質(zhì)細胞反應(yīng)是半抗原被角質(zhì)細胞攝取，發(fā)生炎性反應(yīng)，產(chǎn)生的炎性因子激活樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）；（3）DCs反應(yīng)是DCs 被激活后攝取呈遞抗原，表面特異性標志物表達上升，釋放的細胞因子激活T 細胞；（4）組織/器官層次事件是DCs 提呈相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）后遷移至淋巴結(jié)，T細胞識別MHC 形成特異性T 細胞，當機體再次接觸同種抗原時發(fā)生ACD。與毒性反應(yīng)不同，AOP 最關(guān)鍵的特征是以可檢測到的4 種分子事件的定向關(guān)系為研究要點［17］。

2.1 DPRA化學(xué)法

Gerberick 團隊于2004 年開發(fā)了DPRA 法，該方法模擬致敏物質(zhì)與皮膚蛋白共價結(jié)合形成半抗原（即AOP 通路中起始事件）的過程。采用化學(xué)方法將致敏原與谷胱甘肽以及半胱氨酸和賴氨酸多肽的肽模板反應(yīng)結(jié)合，再使用高效液相色譜-紫外線檢測（high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLC-UV）測定兩種結(jié)合抗原的消耗情況，以此來判定受試物致敏能力［18］。其檢測結(jié)果與LLNA法的一致性可達到89%。該方法已于2015年被OECD收錄至TG 442C指南［19］。

目前該法主要用于單一化學(xué)品或化妝品原料的致敏測定，未能應(yīng)用到化妝品成品檢測。2009 年，Gerberick等［20］對DPRA法進行了改良，在反應(yīng)體系中加入了辣根過氧化物酶-過氧化氫，使該方法擁有檢測抗原前體物的能力，擴大了檢測范圍，為拓展DPRA法的應(yīng)用范圍打下了強有力的基礎(chǔ)。

為了提高檢測通量、靈敏度及準確性，Wei等［21］開發(fā)了一種基于384 孔板的快速固相萃取（solid phase extraction，SPE）-串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS）-DPRA自動化快速檢測法。與HPLC-UV法相比，SPE-MS通量從每份樣品的16 min縮短到10 s，底物使用量也從100 mmol/L 減少到5 μmol/L，大大提高了檢測效率。

2.2 ADRA法

化學(xué)方法代替動物實驗進行皮膚致敏測試的局限性在于，HPLC-UV分析中待測化學(xué)品與親核試劑的共同洗脫，導(dǎo)致無法準確量化未反應(yīng)的親核試劑以及預(yù)測待測物的致敏能力［22］。為解決這個問題，F(xiàn)ujita等［23］開發(fā)并驗證了一種新型的皮膚致敏替代方法，即ADRA法。

該方法的原理與DPRA 法類似，同樣模擬AOP 通路中的起始事件，只是在使用HPLC-UV 定量時改為281 nm 進行，提高了基線穩(wěn)定性。該方法中使用的親核試劑是由Fujita團隊制定合成的兩種氨基酸衍生物乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和乙酰賴氨酸（N-α-acetyl-L-lysine，NAL）［24］。ADRA 法測試終點為NAC/NAL 的反應(yīng)性，即根據(jù)待測物中未反應(yīng)的NAC/NAL 濃度相對于對照組平均濃度下降值而計算出的消耗百分比。

2019年，F(xiàn)ujita團隊通過改用熒光檢測開發(fā)了新的ADRA-熒光檢測法（ADRA-fluorescence detection，ADRA-FL）［25］。相對于傳統(tǒng)ADRA 法使用HPLC-UV和高效液相色譜-熒光法（high performance liquid chromatography-fluorescence， HPLC-FL）， ADRA-FL

測量NAC和NAL時擁有更高的靈敏度和信噪比（指電子設(shè)備或者電子系統(tǒng)中信號與噪聲的比例）。研究人員對化妝品常用植物提取物溶液（蘆薈、甘草、綠茶）分析的結(jié)果顯示，該方法存在預(yù)測多成分物質(zhì)致敏風(fēng)險的可能性，但因受試物中含有免疫抑制劑，故無法評估免疫抑制效應(yīng)。

2.3 KeratinoSensTM/LuSens試驗

半抗原由抗原和皮膚蛋白結(jié)合生成，當其接觸表皮角質(zhì)形成細胞后，可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)（即關(guān)鍵事件2）。在機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，抗氧化應(yīng)激感受器的主要調(diào)控因子Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）與核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān) 因 子2 （nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）相互作用，對改善氧化應(yīng)激至關(guān)重要［26］。

基于上述原理，研究人員開發(fā)了兩種來源于角質(zhì)細胞水平的測試方法KeratinoSensTM和LuSens試驗。這兩種檢測方法的區(qū)別在于抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）不同：KeratinoSensTM試驗的ARE 來源于人的AKR1C2（Aldo-keto reductase family 1 member C2）基因，而后者來自大鼠的NQO1（NAD（P）H quinone dehydrogenase 1）基因［27］。兩種基因均含熒光素酶，因此都以熒光素酶的誘導(dǎo)倍數(shù)（fold of induction，F(xiàn)I）作為評價指標［27］，當FI＞1.5時可判斷受試物為致敏物。

有研究表明，與人類皮膚致敏數(shù)據(jù)以及LLNA 測試結(jié)果相比，KeratinoSensTM試驗的準確率分別為94%和93%，而LuSens 試驗稍低，分別為83%和74%［28］。目前，KeratinoSensTM試驗已被納入OECD 指南442D中［28］，而LuSens試驗還處于驗證階段。

2.4 h-CLAT法

h-CLAT 法的開發(fā)基于AOP 通路的關(guān)鍵事件3 和4（即DCs事件和組織/器官層次事件）。將急性單核細胞白血病THP-1細胞暴露于無細胞毒性的受試物中24 h，終止暴露后收集細胞，利用流式細胞儀測定細胞表面表達物CD86和CD54的相對熒光強度變化［29］，以此為依據(jù)判定待測物是否具有致敏性。

該測試方法需要重復(fù)3次試驗，且保證2次試驗結(jié)果均為有效，才能進行下一步判定。將結(jié)果與陰性對照組進行比對，如CD86＞150%且CD54＞200%，則表明THP-1 細胞被活化，判定受試物為致敏劑。研究表明，h-CLAT 法與LLNA 法的試驗結(jié)果一致性為84%［30］。2018 年，該方法被OECD 納入毒理學(xué)測試指南［31］。

治療前兩組患者的SAS、SDS評分對比差異并不顯著,P>0.05;治療前后比較兩組差異顯著,P<0.05;組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2:

袁園等［32］通過對h-CLAT 法驗證的10 種物質(zhì)分別采用CCK-8細胞增殖/毒性檢測法和流式細胞儀法進行檢測，結(jié)果顯示兩種方法的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.993，一致性很高。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)將IL-8 與CD86結(jié)合作為檢測終點也能夠?qū)χ旅粑镞M行判定［33］。同時，該方法也可以用于篩選致敏生物標志物。Karkhanis 團隊于2021 年利用強致敏劑1-氯-2，4-二硝基苯（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，DNCB）、中等強度致敏劑二氯化鎳（NiCl2）以及陰性對照二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理TPH-1 細胞，通過RNA 測序確定了5 種新型的h-CLAT 標志物：CD109、CD181、CD183、CLEC5A和CD354［34］。

3 基于基因組學(xué)的過敏原快速檢測法

隨著基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對皮膚變態(tài)反應(yīng)發(fā)生機制的研究不斷深入，研究人員將目光投向了基因組學(xué)方面。2011 年，Johansson 等［35］發(fā)現(xiàn)了一種細胞系——人類急性髓細胞白血病細胞系MUTZ-3，其在轉(zhuǎn)錄和誘導(dǎo)特異性T細胞產(chǎn)生應(yīng)答等方面與DCs相似。MUTZ-3 分化后其免疫相關(guān)表型類似于未成熟的DCs，表達CD1d、MHCⅠ和MHCⅡ呈遞抗原，并誘導(dǎo)特異性T細胞增殖。

變態(tài)反應(yīng)產(chǎn)生的生物標志物能夠?qū)χ旅粑锖头侵旅粑镞M行識別，并出現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄結(jié)果。因此，這些不同致敏劑的有效預(yù)測指標統(tǒng)稱為GARD 預(yù)測信號（GARD predictive signals，GPS）。GPS包括與先天免疫反應(yīng)信號、DCs 成熟、應(yīng)激反應(yīng)和外來物質(zhì)識別相關(guān)的基因，有著完整的能夠識別和監(jiān)測皮膚致敏中各種關(guān)鍵事件的能力。基于這一原理，研究人員建立了一種基于MUTZ-3 細胞的GARD 法。該方法的判斷終點是根據(jù)GPS 的轉(zhuǎn)錄水平，使用支持向量機（support vector machine，SVM） 賦予待測樣本一個決定值（decision value，DC）。DC＞0，為致敏劑；DC≤0，則為非致敏劑［36］。

GARD 是一種基于基因組讀數(shù)、新型且靈活的體外致敏評估法，該方法可測試200 個與致敏相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄組的變化。這些基因的生物標志物特征包括參與氧化應(yīng)激、DCs 成熟以及細胞因子反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本［37］。體內(nèi)完整基因組所帶來的巨大的多功能性，為進一步發(fā)展和拓寬皮膚致敏分析方法提供了條件，也為進一步了解體內(nèi)致敏的過程提供了參考。其次，整體基因組讀數(shù)提供的大量信息，還可用于特定信號或代謝途徑機制的研究［38］。此外，GARD法還可用于判定呼吸致敏劑，如Masinja 等［39］發(fā)現(xiàn)了一種能夠區(qū)分呼吸致敏劑和非致敏劑的生物標志物，并整理在尚未公開的數(shù)據(jù)庫中。

4 皮膚致敏替代方法的比較分析

隨著毒理學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展以及人類對動物實驗越來越重視，研究人員逐步將目光投向皮膚致敏試驗替代方法的開發(fā)驗證。因而，越來越多的替代方法如LLNA、LLNA：BrdU-ELISA、DPRA、GARD等相繼出現(xiàn)，并通過驗證。

如表1 所示，各種替代方法均有不同的優(yōu)缺點。這些方法的優(yōu)勢大多集中于實驗動物的使用量減少，甚至是使用細胞替代了實驗動物，靈敏度和準確度較高，以及測試時間縮短等方面。但各個方法的局限性也很突出，尤其是結(jié)果假陽性以及對待測物的性質(zhì)和溶解度要求較高等問題。皮膚致敏AOP 是一個完整的生物過程，而現(xiàn)有的替代方法無法完全覆蓋整個通路，因此有必要通過組合方法來改善。

表1 皮膚致敏替代方法的比較Table 1 Comparison of alternative methods of skin sensitization

5 整合策略與評估方法

皮膚變態(tài)反應(yīng)是一個極為復(fù)雜的過程，憑借單獨的體外測試方法無法完整獲取皮膚致敏信息，若對皮膚致敏反應(yīng)進行更進一步的探索，則需結(jié)合各種替代方法的靈敏度、優(yōu)缺點等方面建立方法組合策略。因此，OECD 于2016 年發(fā)布了整合策略與評估方法來評價未知化合物的致敏性及其致敏效力。整合策略與評估方法是一種基于科學(xué)、實用的化學(xué)危害特征描述方法，即依據(jù)現(xiàn)有的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征信息、毒理學(xué)信息、計算機模型、體外實驗結(jié)果進行的綜合分析及整合測試策略，以評價受試物的致敏性和風(fēng)險類別［54］。

定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure activity relationship，QSAR）是通過分析現(xiàn)有的某一系列具有相同生物活性且結(jié)構(gòu)相似的化合物，以其理化或結(jié)構(gòu)參數(shù)為自變量，生物活性為因變量，利用數(shù)理統(tǒng)計方法，建立化合物結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的定量關(guān)系［58］。QSAR 系統(tǒng)能夠?qū)Χ鄠€毒理學(xué)終點進行預(yù)測。近年來，研究人員嘗試將其應(yīng)用到化妝品皮膚致敏性評價中，開發(fā)了類似的皮膚滲透性QSAR 模型，并闡明了化合物的皮膚滲透性與致敏性之間的關(guān)系［59］。同時，采用計算機模擬QSAR 軟件進行化妝品毒理學(xué)評價，也得到了越來越多的重視，例如化合物毒性預(yù)測工具樹（toxic hazard estimation，Toxtree）、OECD 開發(fā)的QSAR 工具箱（OECD QSAR Toolbox）、組織新陳代謝 模 擬 器（tissue metabolism simulator，TIMES-SS）等［60］。但這類軟件是作為單一致敏評估方法來開發(fā)和驗證的，因此一些國外大型日化企業(yè)將基于AOP 通路的皮膚致敏替代方法與這些QSAR 軟件結(jié)合后自主開發(fā)出皮膚致敏測試整合策略。

目前，OECD 在整合策略與評估方法指導(dǎo)文件中納入的整合策略大都由國外大型日化企業(yè)開發(fā)，例如德國巴斯夫（BASF） 公司開發(fā)的“3 選2”原則（BASF‘2 out of 3’）、美國寶潔（P&G）公司開發(fā)的貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合測試策略（Bayesian network integrated testing strategy）、法國歐萊雅（L’ORéAL）公司開發(fā)的堆疊元模型（Stacking Meta-mode），以及日本資生堂（Shiseido） 公司開發(fā)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析法（artificial neural network）等［61］。

5.1 “3選2”原則

該方法由德國巴斯夫公司開發(fā)，綜合了DPRA、KeratinoSensTM/LuSens 和h-CLAT 這3 種單一替代試驗方法［62］，該方法覆蓋了AOP中至少兩個關(guān)鍵事件。其判定方式為：若3種試驗中有2種結(jié)果呈陽性，則判定受試物為致敏劑，反之則為非致敏劑。與單一試驗相比，該整合策略預(yù)測結(jié)果的準確率為81%～88%。

5.2 貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合測試策略

該方法由美國寶潔公司開發(fā)，在涵蓋了DPRA、KeratinoSensTM和h-CLAT 這3 種單一替代方法的基礎(chǔ)上，增加了TIMES-SS基于受試物結(jié)構(gòu)的預(yù)測以及生物利用度等數(shù)據(jù)信息［63-64］。該方法主要應(yīng)用于致敏性及致敏效力的判斷。與LLNA 結(jié)果相比，致敏性判定的準確率為100%，致敏效力分級的準確率為89%。

5.3 堆疊元模型

該方法由法國歐萊雅公司開發(fā)，在結(jié)合了覆蓋AOP的3個關(guān)鍵事件的DPRA法、KeratinoSensTM法和骨髓U937細胞皮膚致敏試驗（bone marrow U937 cell skin sensitization test，U-SENSTM）這3種單一替代方法的基礎(chǔ)上，又增加了兩種分析工具TIME-SS、Toxtree 以及受試物的理化性質(zhì)，進而結(jié)合5 種不同的統(tǒng)計方法組合而成［65］。該模型的判定方式為：對5種不同統(tǒng)計方法給出的數(shù)據(jù)進行分析后，根據(jù)定義閾值判定受試物是否具有致敏性［66］。與單一試驗方法相比，該方法的準確性為93%。

5.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析法

該方法由日本資生堂公司開發(fā)，覆蓋了AOP 關(guān)鍵事件1～3，同時綜合了受試物的理化性質(zhì)和計算機模擬參數(shù)，構(gòu)成一個非線性統(tǒng)計模型［67］。該方法將DPRA 法、KeratinoSensTM法、ARE、h-CLAT 法和硫醇基蛋白反應(yīng)性測試作為單一元素，利用模型對單一元素的不同組合進行回歸分析，判定受試物的致敏性及致敏效力［68］。與LLNA 法相比，該模型的準確性為91%。

6 小結(jié)

隨著對皮膚致敏機制的深入研究，從LLNA 法到基于AOP 通路建立的替代試驗，以及基于體內(nèi)皮膚致敏過程所建立的整合策略已經(jīng)逐步建立，但目前我們所掌握的AOP 通路還只是很小的一部分，任何體內(nèi)外替代方法都無法完整模擬致敏后體內(nèi)的真實反應(yīng)。因此，建立皮膚致敏替代試驗仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)，尋找能夠模擬出皮膚變態(tài)反應(yīng)整個過程或是關(guān)鍵步驟的替代方法將會是未來皮膚致敏替代方法研究的發(fā)展趨勢。另一方面，伴隨著基因組學(xué)皮膚致敏測試方法的開發(fā)，相信不久的將來，皮膚致敏測試方法必將陸續(xù)迭代，檢測結(jié)果會更加靈敏、準確和快速。

[作者貢獻Author Contribution]

黃靜怡參與討論并確定主體框架，查找及篩選相關(guān)文獻，撰寫初稿并修改；李培寧參與討論并確定主體框架，查找及篩選相關(guān)文獻，參與文稿的修訂；劉香梅共同討論并確定文章主體框架，參與文稿修訂；劉忠華共同討論并確定文章主體框架，并對整體框架給予修改意見；黃宇鋒共同討論并確定文章主體框架，審核初稿并給予修改意見。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。