大鼠急性牙髓炎痛敏模型的疼痛效應評價

趙斯佳, 何新宇, 景 泉, 馬 林, 郭春嵐, 萬 闊

(中國醫學科學院北京協和醫院口腔科,北京 100730)

急性牙髓炎（acute pulpitis）是指牙髓組織在病原刺激下發生牙髓炎性病變，其特征是起病急、自發痛、放射痛以及冷刺激可誘發持續劇烈牙痛［1］，且口服止痛藥的治療效果不佳。急性牙髓炎的發病率約占急性牙痛患者的45%，是口腔急癥就診的首位疾病［2］。急性牙髓炎的疼痛反應雖然給患者帶來巨大痛苦，但其也可以給牙髓炎癥狀態的診斷提供依據，例如牙齒冷刺激一過性或持續性疼痛，常作為判斷牙髓炎癥嚴重程度的標準［1］。目前針對急性牙髓炎疼痛的研究主要集中于對牙髓炎患者進行多種痛覺過敏指標的測量，以及對牙髓炎大鼠進行炎癥及疼痛分子指標的檢測，而對急性牙髓炎大鼠疼痛癥狀的效應評價鮮有報告。

建立恰當的急性牙髓炎疼痛效應模型，是推動牙髓炎疼痛機制研究和開發新治療方式過程中必不可少的重要環節。曾有研究者采用燒熱器械接觸牙髓炎患牙誘導大鼠嘶叫［3］，或對大鼠牙髓炎患牙周圍面頰部皮膚或舌體進行觸碰引發頭部退縮反射［4］等方法進行疼痛模型的評估，然而以上研究均未系統、完整地對大鼠牙髓炎模型進行疼痛效應評價。本研究參考牙髓炎動物的經典造模方法，使用髓腔內置入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 及親水暫封材Caviton 暫封造模［5］，通過對大鼠牙髓炎癥以及若干疼痛行為學指標進行觀察，分別從疼痛行為、牙髓組織形態學變化、血清炎性因子表達這3 個方面，驗證大鼠急性牙髓炎痛敏模型的有效性，以期為后續牙髓炎疼痛的傳導機制及有效鎮痛藥物的篩選研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠，體質量為（220±20）g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK （京） 2016-0011］， 質 量 合 格 證 號 為110011211108238156。大鼠飼養于北京協和醫院動物實驗中心［SYXK（京）2020-0026］。飼養環境：室溫（23±2）℃，12 h循環燈光，自由飲食。本實驗方案通過北京協和醫院實驗動物福利倫理委員會審核批準（倫理審批號：XHDW-2019-019），所有操作均遵循中華人民共和國《實驗動物管理條例》及相關要求。

1.2 主要儀器與試劑

異氟烷購自上海恒豐強動物藥業有限公司（批號20200303）； LPS 購 自 美 國Sigma 公 司（批 號20201210）；Caviton 購自日本而至陶齒工業株式會社（批號2012091）；4%多聚甲醛組織固定液（批號20200904）、EDTA 脫鈣液（批號20200618）和HE 染色試劑盒（批號20201207）均購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測用ELISA 試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司（批號分別為A301B10755、A38210815）。動物麻醉機為天津森迪恒生科技公司產品（型號SD-MIII）；大鼠口腔手術用鼻罩為本實驗室自制（專利號：ZL 2020 2 2238865.5）；冷熱板測痛儀為北京眾實迪創科技公司產品（型號1056316）；Von Frey Hairs Test 觸覺纖維絲為美國Stoelting 公司產品（型號Von-Frey）；牙齒冷測試儀為南京卡爾文生物科技有限公司產品（型號KW-YL），動物行為視頻跟蹤分析系統為深圳市騰安科技有限公司產品（型號TSAFE-JK6985）。

1.3 分組與造模

將大鼠適應性喂養1 周后，采用隨機數字表法進行分組：45 只雄性SD 大鼠分為空白對照組（SHAM組）、脂多糖組（LPS組）、生理鹽水組（NS組），每組15只。LPS組造模方法：2%異氟烷吸入麻醉下將大鼠的右側上磨牙開髓，表面放置浸滿5 g/L LPS 溶液的棉球，待棉球作用30 min后，Caviton暫封；NS組以同樣方式封入生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）；SHAM組僅進行異氟烷麻醉。實驗前將每組15 只大鼠隨機放入5個籠子中，每籠3 只，分別于造模前（記為0 h）及造模后2 h、24 h、48 h和72 h，隨機選取3只大鼠，依次進行自發性疼痛行為學評分、疼痛指標測定及處死取材。

1.4 自發性疼痛行為學評分

分別于造模前及造模后2 h、24 h、48 h 和72 h 將大鼠逐一置于70 cm×70 cm×30 cm（長×寬×高）的有機玻璃透明觀察箱中。待大鼠預適應30 min 后，使用架空于實驗場上方2 m 的視頻跟蹤系統記錄動物在觀察箱內30 min 的行為，記錄參數包括活動時間（測試過程中的動作秒數）、面部梳理時間和直立時間。時間記錄采用秒表測量后人工計算。

1.5 機械痛閾檢測

1.5.1 足機械刺激反射

分別于造模前及造模后2 h、24 h、48 h 和72 h，采用Chaplan 等［6］創建的Up-Down 方法對3 組大鼠進行機械痛閾的檢測。測量前將大鼠置于特定的鐵絲網上，并蓋上透明的有機玻璃罩（20 cm×20 cm×15 cm），使大鼠適應環境30 min。待大鼠安靜（停止梳理毛發和探索活動）后，選用不同的Von Frey 刺激絲（力量分別為0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g、26.0 g），以4.0 g 開始將Von-Frey 絲垂直刺向大鼠后足的足底中央（避開足墊），垂直用力使其輕微彎曲；每次的刺激時間≤5 s，間隔時間＞2 min。當大鼠出現縮足或舔足行為即為陽性反應，記為“X”，下一次更換低一級力度進行刺激；反之，若出現陰性反應（大鼠無縮足或舔足行為），記為“O”，下一次換高一級力度進行刺激。由此可得到一串以“O”或“X”組合的序列。以第一次出現“X”的前一次“O”作為起點，選擇包括該起點的連續6 次的檢測結果作為推算50%縮足反射閾值（paw withdrawal threshold，PWT）的關鍵序列。計算公式為50% PWT（g）= 10（xf+kδ）/10 000，式中xf為序列中最末次檢測Von Frey 纖維絲的對數值，k為根據檢測所得“X”“O”序列查表所得，δ為0.231。

1.5.2 舌機械刺激反射

分別于造模前及造模后2 h、24 h、48 h 和72 h，在2%異氟烷輕度麻醉下，對大鼠造模牙齒側舌緣（舌尖后方3 mm）部位進行機械刺激，將雙極搪瓷涂層不銹鋼絲電極放置在頭夾肌中記錄反射響應肌電圖（電極間距離5～6 mm），測定頭部退縮反射閾值（head withdrawal threshold，HWT）［7］。具體是用塑料繩輕輕牽動大鼠下頜，拉開大鼠口腔，使用尖端扁平的鉗子將0～130 g 的機械刺激作用于造模牙同側的舌外側邊緣進行機械刺激測試；刺激速度由人工控制，連續從0 g 到閾值，速度約為10 g/s，誘發頭部肌電活動改變的機械刺激閾值強度被定義為舌機械刺激HWT。

1.6 冷痛敏檢測

1.6.1 足趾冷刺激反射

分別于造模前及造模后2 h、24 h、48 h 和72 h，采用足底冷板測試儀檢測兩組大鼠患側縮足反射潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）。測量時將大鼠置于透明冷板測痛儀上，室溫保持在（25±2）℃。大鼠安靜（停止梳理毛發和探索性活動）后，從開始足底冷刺激至大鼠出現抬腿回避時的時間作為大鼠的冷刺激PWL。每只腳測試3次，每次間隔5～6 min，取3次結果的平均值［8］。

1.6.2 牙齒冷刺激反射

分別于造模前及造模后2 h、24 h、48 h 和72 h，在2%異氟烷輕度麻醉下，使用牙冷測試儀對大鼠造模牙齒表面施加逐漸降溫至零度的冷刺激，將雙極搪瓷涂層不銹鋼絲電極放置在頭夾肌中記錄反射響應肌電圖（電極間距離5～6 mm），測定牙齒冷痛敏潛伏期。具體是用塑料繩輕輕牽動大鼠下頜，拉開大鼠口腔，將測試儀探頭置于造模牙齒表面；開啟儀器，探頭從室溫降至0 ℃大約需要180 s，降溫過程中冷刺激牙齒誘發肌電活動的接觸秒數定義為牙齒冷刺激誘發頭部退縮反射潛伏期（head withdrawal latency，HWL）；采用冷刺激3 次，每次間隔5～6 min，取3 次結果的平均值。

1.7 外周血炎性指標檢測

分別于造模前及造模后的2 h、24 h、48 h和72 h，痛閾指標檢測完成后，將異氟烷劑量迅速調大至5%；待大鼠失去意識后，采集各組大鼠心臟血液；血液經離心（2 000 r/min）后，留取血清，采用ELISA法測定各組大鼠血清中IL-1β和TNF-α水平。

1.8 牙髓組織病理學觀察

3組大鼠分別于造模前及造模后的2 h、24 h、48 h和72 h，5%異氟烷麻醉取血后斷頸處死，然后將右側造模患牙及周圍牙槽骨完整取出，用質量分數為4%的多聚甲醛溶液固定，用EDTA溶液浸泡脫鈣8周，脫水包埋切片后進行蘇木精-伊紅染色。光學顯微鏡下觀察組織病理學改變。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠的自發疼痛行為學差異

造模前，3組大鼠的自發性疼痛行為學評分均無明顯差異。造模后2 h、24 h、48 h 和72 h，NS 組大鼠面部梳理時間顯著多于SHAM 組，同時LPS 組大鼠面部梳理時間明顯多于SHAM 組和NS 組（P＜0.01 或P＜0.05），提示造模后大鼠面部呈現漸進性疼痛（圖1A）。造模后48 h，LPS組大鼠的直立時間較SHAM組明顯升高（P＜0.05），其余組間未見明顯差異（P＞0.05，圖1B）。造模后各組大鼠的活動時間差異均沒有統計學意義（P＞0.05，圖1C）。

圖1 急性牙髓炎模型大鼠自發性疼痛行為學評價Figure 1 Evaluation of spontaneous pain in acute pulpitis model rats

2.2 各組大鼠的機械痛覺過敏行為學差異

造模前，3組大鼠的50%PWT均無明顯差異（P＞0.05）；造模后，LPS 組和NS 組之間大鼠50% PWT 差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后2 h、24 h、48 h和72 h，NS 組大鼠的50%HWT 明顯低于SHAM 組（P＜0.01 或P＜0.05）；造模后2 h、48 h 和72 h，LPS 組大鼠的50% HWT 明顯低于SHAM 組（P＜0.01 或P＜0.05），提示大鼠發生機械痛覺過敏現象（圖2A）。

造模前，3組大鼠HWT未見明顯差異（P＞0.05）；造模后72 h，3組間HWT 也未見明顯差異（P＞0.05）。造模后24 h，NS 組大鼠的HWT 明顯低于SHAM 組（P＜0.01）；造模后2 h、24 h 及48 h，LPS 組大鼠的HWT明顯低于SHAM組及NS組（P＜0.01），提示大鼠出現面部機械痛覺過敏（圖2B）。

2.3 各組大鼠的冷刺激痛覺過敏差異

造模前，3 組大鼠PWL 均無明顯差異（P＞0.05）。造模后2 h，NS 組大鼠PWL 較SHAM 組明顯升高（P＜0.05）；造模后48 h，NS 組大鼠PWL 較SHAM 組明顯降低（P＜0.05）；造模后48 h和72 h，LPS組PWL較SHAM組明顯降低（P＜0.01）；造模后72 h，LPS組PWL 較SHAM 組 及NS 組 明 顯 減 低（P＜0.01）（圖2C）。

造模前，3組大鼠HWL均無明顯差異（P＞0.05）。造模后2 h 和24 h，NS 組大鼠較SHAM 組大鼠的HWL明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）；造模后2 h、24 h、48 h和72 h，LPS組較SHAM組大鼠的HWL明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）；造模后的2 h和48 h，LPS組較NS組大鼠的HWL 明顯降低（P＜0.01 或P＜0.05），提示大鼠出現牙齒冷刺激痛覺過敏（圖2D）。

圖2 急性牙髓炎模型大鼠機械刺激及冷刺激下的痛閾變化Figure 2 Mechanical and cold pain threshold of acute pulpitis model rats

2.4 各組大鼠的患牙組織病理學變化

HE 染色結果提示，造模后24 h，LPS 組可見穿髓點下方呈現以中性粒細胞浸潤為主的急性漿液性炎癥，局部充血；成牙本質細胞層排列稍紊亂；部分牙髓變性壞死，根髓基本正常（圖3A）。NS 組與LPS 組情況基本相同（圖3E）。SHAM 組成牙本質細胞排列規則，未見明顯的炎性細胞浸潤及血管擴張（圖3D）。

造模后48 h，LPS 組穿髓點周圍呈現部分灶性壞死，中性粒細胞浸潤較前更為明顯；成牙本質細胞層排列稍紊亂；根髓充血（圖3B）。NS 組與LPS 組情況基本相同（圖3F）。

造模后72 h，LPS組冠髓區范圍擴大，累及上段根髓，周圍有大量粒細胞和部分單核-巨噬細胞浸潤，偶見淋巴細胞；炎細胞浸潤區周圍可見少量纖維組織包繞，成纖維細胞增生，部分細胞呈環狀排列；根髓小血管明顯擴張，根髓成牙本質細胞排列紊亂、變性，無炎細胞浸潤（圖3C）。與LPS 組相比，NS 組炎癥表現程度較輕（圖3G）。

圖3 LPS和NS誘導大鼠急性牙髓炎的組織病理變化（HE，40倍）Figure 3 Histopathological changes of LPS and NS induced acute pulpitis in rats（HE，×40）

2.5 各組大鼠的血清IL-1β和TNF-α蛋白表達水平

造模后，LPS組和NS組大鼠血清中IL-1β和TNFα蛋白表達水平顯著高于SHAM組（P＜0.01），并均在造模后48 h 達到最高值；造模后24 h 和48 h，LPS 組IL-1β 蛋白表達水平顯著高于NS 組（P＜0.01）；造模后2 h、24 h、48 h 和72 h，LPS 組TNF-α 蛋白表達水平明顯高于NS組（P＜0.01或P＜0.05）（圖4）。

圖4 急性牙髓炎模型大鼠血清炎癥因子水平變化Figure 4 Changes in serum inflammatory factors in acute pulpitis model rats

3 討論

急性牙髓炎痛敏評價模型的建立是研究牙痛傳導機制的基礎。通過在動物模型上模擬臨床急性牙髓炎的發生發展過程，研究者可以重現急性牙髓炎的癥狀體征以及病理改變，并進一步探究牙髓炎的發病機制及開發牙痛治療新方法。目前，國內外有多種成熟的牙髓炎造模方法，然而對牙髓炎動物模型的痛敏評價較為簡單粗糙，缺乏一個完善的系統。

由于疼痛效應測量體系的影響因素復雜多樣，因此選擇穩定的急性牙髓炎造模方法，穩定可控地完成疾病模型的建立十分重要。牙髓炎的病理改變可分為三種類型：Ⅰ型為牙髓輕度損傷無壞死；Ⅱ型為中度牙髓損傷，牙髓部分壞死；Ⅲ型為不可逆性牙髓炎，牙髓逐步壞死并出現全身炎性反應［9］。本研究選取穩定的Ⅲ型牙髓病理結果作為造模標準，并進行痛敏評價。目前，不可逆性牙髓炎的造模方法主要包括LPS誘導法、弗氏佐劑誘導法、軟齲置入法、牙髓暴露法等［10］。由于弗氏佐劑誘導大鼠牙髓炎的病程較長，軟齲置入法具有較大的操作誤差，牙髓暴露法將牙髓直接暴露于口腔環境，因此均不利于建立穩定的急性牙髓炎模型。LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的組成部分，廣泛存在于組織炎性反應中［11］。本研究采取LPS誘導法進行大鼠急性牙髓炎的造模。病理結果顯示，造模后24～72 h，LPS模型組冠髓區域出現充血至灶性壞死表現，炎癥范圍逐漸擴散至根髓區域。顧斌等［12］采用將LPS 紙尖封入窩洞后暫封的方法，由于紙尖吸納的LPS 劑量大，病程進展較快，造模后48 h 可見冠髓區膿腫明顯，根髓散在大量中性粒細胞，部分動物出現牙槽骨膿腫。牙髓暴露法建立牙髓炎模型的相對病程較長，造模后7～14 d 患牙的冠髓及根髓相繼壞死［10，13-14］。

急性牙髓炎的疼痛表現多樣，包括自發牙痛、臨近組織放射痛和冷刺激誘發神經痛［15］。目前，牙髓炎疼痛的傳導機制尚不明確。有學者提出，牙髓炎機械刺激及冷刺激疼痛可能是外周感受器和中樞神經系統敏化［16］共同導致的痛覺超敏現象［17］。曾有多位學者建立大鼠牙髓炎模型并進行疼痛評價，但檢測部位多為牙齒旁邊組織如面部皮膚、舌體組織，檢測類型多為機械痛閾的測定［4，7-19］。雖然面部皮膚、舌體、牙髓均為三叉神經分支的分布區域，但牙齒與軟組織在解剖結構上存在明顯差異。目前的研究存在缺少對牙齒痛閾的檢測、痛閾類型測量不夠全面、外周與中樞敏化檢測尚未得到有效區分等問題。因此，需要新的痛敏評價體系對大鼠疼痛狀態進行包括患牙在內多部位、多方法的系統性評價。

本研究結果顯示，在自發痛行為評價中，LPS 組與NS組的大鼠面部梳理時間均隨牙髓炎的炎癥程度加重而顯著增加，與Lin等［4］研究一致。LPS組與NS組存在顯著差異，可見面部梳理時間可較為準確地反映大鼠牙髓炎自發痛的程度。活動時間和直立時間分別反映了大鼠自發行為和探索行為［18］。本研究并未直接評估頜面部大鼠行為，對口腔頜面部疼痛評估的特異性欠佳。本實驗發現，造模后大鼠足爪50% PWT 和HWT 明顯降低，提示外周及中樞機械痛覺過敏的發生，與Ohara 等［7］和Watase 等［19］學者的研究結果一致。本實驗中，對造模后不同時間的血清炎癥因子IL-1β和TNF-α進行檢測，結果顯示，IL-1β和TNF-α在造模后升高，并在術后48 h 達到峰值。Lin 等［4］研究表明，急性牙髓炎模型大鼠血清炎癥因子IL-1β 和TNF-α水平在術后1 d時顯著升高。IL-1β和TNF-α可增加神經元的興奮性和敏感性，從而導致溫度及機械痛覺過敏。此外，Worsley 等［20］也證實，大鼠牙髓炎癥可導致長期中樞致敏改變。

此前尚無大鼠急性牙髓炎的冷刺激痛覺過敏研究。本實驗結果發現，LPS 組與NS 組大鼠牙齒冷刺激痛覺過敏閾值降低，且兩組間存在顯著差異；而足爪冷刺激閾值差異不明顯，與臨床研究結果存在一致性。臨床研究顯示，不可逆性牙髓炎患者的口內機械痛覺過敏及冷痛覺過敏反應的發生率明顯高于健康人群［21］，牙本質過敏［22］和不典型牙痛患者［23］的牙齒冷刺激敏感程度均有升高，而全身冷刺激閾值無明顯改變。因此，牙齒冷刺激痛覺過敏可能僅與牙齒內部神經元改變有關。最近一項研究通過體外制備小鼠下頜神經超活體模型發現，成牙本質細胞是牙齒冷傳導的起始部位［24］。

綜上所述，本實驗成功建立了大鼠急性牙髓炎痛敏評價模型，該模型可有效引發大鼠的局部牙髓炎癥狀，疼痛效應評價符合牙髓炎患者的臨床測試結果。由于實驗研究對象是大鼠的主觀感受，在模型動物以及實驗者主觀感覺判斷上均存在一定程度的不穩定性，因此導致本實驗中部分痛閾指標存在標準誤較大的情況；但是血清學檢測結果相對穩定，證實了本研究造模的可信性。此外，本實驗還存在著疼痛評價較為復雜、疼痛機制研究不夠深入等問題，仍需要繼續探索。總之，急性牙髓炎痛敏模型對牙髓炎疼痛傳導、外周及中樞致敏機制以及牙痛治療方法研究具有重要的應用價值，值得進一步推廣。

［醫學倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究涉及的所有動物實驗均已通過北京協和醫院實驗動物管理與倫理委員會審查批準（倫理審批號：XHDW-2019-019）。所有實驗過程均遵照實驗動物相關法律法規條例要求進行。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Ethics Committee of Peking Union Medical College Hospital（Approval Letter No. XHDW-2019-019），and all experimental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations（01/03/2017），Laboratory Animal：Guideline for Ethical Review of Animal Welfare（GB/T 35892—2018） and ARRIVE 2.0.

[作者貢獻Author Contribution]

趙斯佳負責實驗設計、采集分析數據和文章撰寫；何新宇負責實驗內容補充整理和文章修改指導；景泉負責實驗相關英文材料的翻譯和整理；馬林和郭春嵐負責實驗指導和技術支持；萬闊負責實驗指導和經費支持。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。