QuEChERS/HPLC測定土壤中4種酰胺類殺蟲劑的殘留

劉伶俐，索紋紋，徐飛良，黃向榮，萬譯文

(1.湖南省水產科學研究所，中國 長沙 410153;2.農業農村部漁業產品質量監督檢驗測試中心(長沙)，中國 長沙 410153;3.湖南省飼料工業辦公室，中國 長沙 410011;4.水產高效健康生產湖南省協同創新中心，中國 常德 415000)

有機磷、有機氯等農藥因具有高毒或劇毒而逐漸被各國所限用或禁用，且大量、頻繁地使用這些農藥也使害蟲產生了抗藥性[1]。土壤作為農藥在環境中的蓄積地，其降解速度較慢，持續性、高濃度使用高毒農藥可能會對水體、大氣、農產品等產生不同程度的化學污染和殘留風險，進而給食用者的健康帶來潛在危害[2]，因此研究開發毒性低、高效且與環境相容性好的新穎殺蟲劑，已成為國內外關注的焦點[3]。作為甲胺磷、馬拉硫磷的替代品，低毒、高效的酰胺類殺蟲劑(以氯蟲苯甲酰胺[4]、氟蟲雙酰胺[5]、唑蟲酰胺[6]及氟啶蟲酰胺[7]為代表)在農業生產中大面積推廣應用。但隨著使用劑量的不斷增大，殺蟲劑與環境和農產品之間的安全問題就逐漸顯現[8]，為此國際食品法典委員會、美國、日本、歐盟等均制定了國際公約、法規及限量標準，對合理科學使用農藥、保護環境起到了積極的作用。但我國GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留量》僅對唑蟲酰胺的最大殘留限量(MRL)進行了規定，對另外3種僅作了臨時限量規定[9]。

目前，關于4種酰胺類殺蟲劑的報道更多地集中于單個物質的殘留分析檢測[10，11]、降解動態研究[12-14]，分析方法主要有液相色譜法[6，13]、液相色譜-質譜法[10，11]。目前，采用同一種前處理方法及色譜檢測條件測定土壤中4種酰胺類殺蟲劑殘留量的研究尚未見報道。本研究采用分散固相萃取(QuEChERS)凈化結合HPLC法，同時測定土壤中氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺的殘留量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

配備紫外檢測器(UV)的LC-20型高效液相色譜儀(島津公司，日本)；R-3平行蒸發器(布奇公司，瑞士)；Lab M64氮吹濃縮裝置(北京萊伯泰科儀器股份有限公司，中國)，Z323K高速離心機(賀默公司，德國)；BX8200HP超聲波清洗器(上海新苗醫療械制造有限公司，中國)；SHA82A 數顯水浴恒溫振蕩器(金壇市品玻實驗儀器廠，中國)。

氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺標準品(純度≥97.0%，Dr公司，德國)，乙腈(色譜純，默克公司，德國)，PSA(N-丙基乙二胺，粒徑：40～63 μm)，C18硅膠(粒徑：60～200 μm)，實驗用水符合GB/T 6682中一級水的規定。

1.2 分析步驟及方法

1.2.1 樣品提取及凈化 準確稱取篩分好的土壤樣品10.00 g(±0.02 g)置于50 mL 錐形瓶中，加入20 mL乙腈，混勻后加蓋超聲提取10 min，再置于振蕩器中提取24 h。將上清液全部轉移至50 mL離心管中，在6 000 r·min-1下離心10 min。準確吸取10.00 mL上清液，將其轉移到離心管或蒸發管中，在45 ℃下氮吹或蒸至近干。隨后加入1.00 mL流動相、1.00 mL乙腈渦旋混勻以溶解殘渣，并全部轉移至10 mL離心管中。加入100 mg PSA和100 mg C18 混勻，6 000 r·min-1下離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，以供高效液相色譜儀進行測定。

1.2.2 色譜條件的設定 采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動相采用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨溶液等度洗脫，流速0.8 mL·min-1，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，檢測波長265 nm。

1.2.3 標準曲線的配制及繪制 分別準確稱取氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、唑蟲酰胺和氟啶蟲酰胺的標準品適量，用乙腈稀釋定容至100 mL，配制成濃度為100 mg·L-1的標準儲備液，在-18 ℃下避光保存，有效期為6個月。分別準確移取標準儲備液適量，并用乙腈稀釋配制成0.05，0.1，0.5，1.0，5.0 mg·L-1的系列標準工作液，現配現用。采用標準溶液質量濃度(x，單位為mg·L-1)與峰面積(y)來進行標準曲線的繪制。

1.2.4 添加與回收 在未施過上述4種殺蟲劑的土壤中添加氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺標準溶液，其添加質量比分別為0.2，1.0，2.0 μg·g-1；在未施過上述4種殺蟲劑的土壤中添加唑蟲酰胺標準溶液，其添加質量比分別為0.4，2.0，4.0 μg·g-1。每個處理設計6次重復，以此計算添加回收率的平均值和相對標準偏差(RSD值)。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

有文獻報道[15，16]，將氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、氟蟲雙酰胺的標準溶液進行紫外光譜或DAD全波長掃描，在200～300 nm均有較好的紫外吸收，筆者對4種酰胺類殺蟲劑的標準溶液進行210 nm和265 nm的紫外掃描，得到相應的紫外吸收光譜圖(限于篇幅，以氟啶蟲酰胺為例，見圖1)。210 nm的色譜圖中，乙腈溶劑峰的影響較為明顯，并且干擾氟啶蟲酰胺的出峰及定量；當選用265 nm作為檢測波長時，4種物質均有較強的吸收峰，同時雜質響應值小、溶劑干擾較小、實驗分析過程穩定，因此最終確定265 nm作為檢測波長。

圖1 土壤中不同波長氟啶蟲酰胺色譜圖Fig. 1 Chromatograms of different wavelengths of Flonicamie in soil

2.2 提取溶劑的優化

提取土壤中農藥殘留時多采用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈或其組合等作為提取劑。覃國新等[17]的試驗結果表明，用二氯甲烷做提取溶劑時，氟蟲雙酰胺的回收率低，用乙酸乙酯提取時效果較為理想；甲醇提取物基質復雜、樣品中水分和干擾物難以凈化，乙腈比乙酸乙酯極性大、分子小、提取能力更強。筆者以乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷為提取劑，比較其對土壤中4種殺蟲劑的提取效果，結果見圖2。經乙腈提取的氟啶蟲酰胺和氟蟲雙酰胺的回收率均可達80%以上，氯蟲苯甲酰胺和唑蟲酰胺的回收率也在75%以上。乙酸乙酯作為提取劑，耗費大量的有機溶劑，對氟蟲雙酰胺的損失較大、回收率達不到要求；甲醇作為提取劑，雜質對目標峰有一定的干擾，唑蟲酰胺丟失，不滿足實驗要求；二氯甲烷作為提取劑，提取液渾濁、雜質干擾明顯，且氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺的提取效果極低，均達不到實驗要求。故最終選用乙腈作為土壤的提取劑，以確保目標物能被有效提取。

圖2 土壤中4種提取劑色譜圖Fig. 2 Chromatograms of four kinds of extractants in soil

2.3 凈化條件的優化

土壤樣品因其本身基質較為復雜，干擾因素較多，需要進行適當的凈化處理才能排除干擾、獲得較好的分離效果。土壤樣品有多種凈化方法，如固相萃取凈化[18]、凝膠滲透色譜凈化[19]等，但這些凈化方法較為復雜、耗時長、成本高，現多采用QuEChERS方法或改進的QuEChERS方法進行樣品的凈化，依據不同的基質，靈活地選擇萃取溶劑和吸附劑，以更為快速、經濟、高效地凈化樣品[20-22]。本文對比了C18，PSA和炭黑的凈化效果，試驗結果表明，炭黑凈化會導致唑蟲酰胺回收率偏低或丟失；C18和PSA的凈化效果較為理想，4種物質的回收率均在75%以上。C18和PSA加入量不同對4種物質回收率的影響結果見表1。隨著C18和PSA用量的增加，其雜質含量降低、凈化效果亦有所提升，但氯蟲苯甲酰胺的回收率會降低。為保持良好的添加回收率并達到去除雜質的目的，筆者最終選用C18和PSA加入量均為100 mg的方案，其回收率均在80%以上，且雜質干擾較少。

表1 C18和PSA不同加入量對4種物質回收率的影響Table 1 The influence of different dosage of C18 and PSA on the recovery of four substances

2.4 流動相體積比對分離效果的影響

為了獲得較好的對目標物質的保留分離效果及其響應，何旭峰等[2]對比了甲醇及乙腈與水的混合流動相，發現以乙腈為流動相時能得到較好的分離效果和較高的靈敏度，在此流動相中添加乙酸銨后，目標物質的峰型和響應更好。筆者選用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨水溶液體系為流動相，按不同體積比(80∶20，60∶40，50∶50，40∶60，20∶80)進行比較試驗。結果發現：當采用梯度洗脫時，目標物基線不平穩，氟蟲雙酰胺及唑蟲酰胺出峰時間較晚，且峰形不對稱，見圖3；而采用等度洗脫時，4種物質的峰型均較尖銳，也無溶劑峰的干擾，出峰時間明顯縮短，提高了檢測效率。當乙腈和0.1 mol·L-1乙酸銨水溶液的體積比為60∶40時，4種物質的出峰時間較早、峰型較好、分離效果滿足殘留檢測要求。

圖3 不同洗脫方式下4種酰胺類物質色譜圖Fig. 3 Chromatograms of four amides in different elution modes of mobile phase

2.5 標準曲線線性回歸方程和靈敏度

按照1.2.3的方法進行標準工作液的配制，并按照上述色譜條件上機測定；以3倍和10倍信噪比(S/N值)分別確定土壤中4種物質的檢出限(LOD值)和定量限(LOQ值)，其線性回歸方程、相關系數、LOD和LOQ值見表2。各參數優化后，4種酰胺類物質在 0.05～5.0 mg·L-1范圍內均具有良好的線性關系，其相關系數均大于0.999 9。實驗得出氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和氟啶蟲酰胺的LOD值均為0.20 μg·g-1，唑蟲酰胺的LOD值為0.40 μg·g-1，此結果表明該方法適用于土壤中4種酰胺類殺蟲劑的定量測定。

表2 4種物質的線性回歸方程、相關系數、檢出限及定量限Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and quantitative limits of four amide insecticides

2.6 方法準確度及精密度

以不含氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺、唑蟲酰胺和氟啶蟲酰胺的土壤樣品為本底，氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺添加量為0.2～2.0 μg·g-1，唑蟲酰胺添加量為0.4～4.0 μg·g-1，按照1.2方法進行回收率和精密度實驗。從表3可以看出，土壤中氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和氟啶蟲酰胺在0.2，1.0，2.0 μg·g-1時的回收率為96.7%～106%，RSD值為1.42%～2.60%；唑蟲酰胺在0.4，2.0，4.0 μg·g-1時的回收率為88.2%～98.7%，RSD值為1.04%～1.16%，表明該方法回收率高、精密度好，適用于土壤中4種酰胺類殺蟲劑的檢測要求。

表3 空白土壤方法準確度和精密度結果(n=6)Table 3 Test results of accuracy and precision for the method from soil samples(n=6)

3 結論

本文建立了QuEChERS凈化結合HPLC同時測定土壤中氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺和氟蟲雙酰胺殘留量的檢測方法。本方法具有定量準確、重復性好、線性關系良好、精密度高等特點，適用于同時測定土壤中氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺和氟蟲雙酰胺的殘留量。