從廢舊報紙中分離高產纖維素酶菌種的鑒定和研究

曹哲，閆雅清瀅，于靜怡，吳玲艷，路婉婷，于欣悅，徐佳璐，鄭苗苗

從廢舊報紙中分離高產纖維素酶菌種的鑒定和研究

曹哲1，閆雅清瀅1，于靜怡1，吳玲艷1，路婉婷1，于欣悅1，徐佳璐2，鄭苗苗1

（1. 哈爾濱學院 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫科大學 口腔醫學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目前，造紙行業是對森林資源消耗最大的產業，每年用于造紙消耗的木材數量巨大．以預處理的廢報紙漿為原料，在一定條件下篩選產纖維素酶菌株，應用于廢紙紙漿脫墨研究，考察了濃度、時間、溫度對廢報紙中分離高產纖維素酶菌種的影響，并采用簡單染色、革蘭氏染色和剛果平板法進行菌株鑒定．結果表明，以報紙為唯一營養源，進行搖床培養，從培養液中分離純化出一株短桿狀具有芽孢的革蘭氏陽性菌．以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源，最終篩選出具有高產能力的產纖維素酶菌株，命名為QQ1128.1．提取16S rDNA，經PCR擴增和序列測序后，構建系統發育樹，鑒定細菌QQ1128.1為芽孢桿菌屬的一個新種．獲得的脫墨菌種能夠提高再生資源的有效利用，實現國家生態文明建設．

纖維素酶；16S rDNA；篩選；鑒定

隨著科技飛速發展，纖維素酶在食品、醫藥、紡織、造紙和能源等工業中得到了廣泛應用[1]．目前，我國林木資源匱乏，并且面臨著“植樹不見樹、造林難成林”的問題，而紙張的主要成分來源于林木資源．我國紙漿消耗量居亞洲首位，導致紙漿進口依賴很大[2]257．當今廢舊報紙、書、雜志等廢紙浪費嚴重，因此，回收利用廢紙對林木資源的緊張有一定的緩解，而且可以減少對國外紙漿的進口量．

廢紙脫墨是回收廢紙不可或缺的一部分，一般的對廢紙進行脫墨的方法會用到化學方法，但是這種方法要用到大量的化學物質，如NaOH、Na2SiO3、Na2CO3、H2O2、螯合劑、表面活性劑等，對環境造成污染．除此之外還有洗滌脫墨、浮選脫墨、蒸汽爆破、溶劑脫墨和生物酶脫墨等方法．對廢紙脫墨時用生物酶法不僅可以提高廢紙的脫墨作用和效果，還可以削減化學藥品對環境的破壞．現在對廢紙進行脫墨的探究和鉆研主要是對脂肪酶、漆酶、纖維素酶等，通常是把纖維素酶和其他酶結合起來進行應用[2]258．雖然國內外對纖維素酶用于脫墨進行了廣泛大量的研究[3]，但很少有直接以報紙為唯一營養源進行培養并從報紙培養液里分離篩選可以產生纖維素酶細菌，然后將篩選出的菌株用于對廢紙進行脫墨的研究中．菌種篩選和培育主要有2種方法[4-6]：一是以得到有更高的產纖維素酶能力的菌株為目的，從可以分解纖維素的菌源中篩選分離出所需要的菌株；二是用誘變育種法，獲得可以產生纖維素酶并且具有高產能力的菌株．隨著DNA體外重組技術的不斷完善和進步，國內外已經有大量科研工作者將DNA體外重組技術用于改造或創造出具有高產纖維素酶能力的菌株中．

本研究擬從以報紙為唯一營養源的報紙培養液中篩選出一株可以產生纖維素酶并且具有高產能力的菌株，并鑒定篩選出的菌株，該實驗為具有高產纖維素酶能力的菌株對廢紙進行脫墨提供一定的研究依據．目前實驗已完成菌株的分離，并將獲得的新型脫墨菌株——枯草芽孢桿菌保存于中國微生物菌種保藏中心．已經完成產品迭代并制作出復合生物菌劑，且已經得到良好反饋．

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

顯微鏡（蘇州南光電子科技有限公司）；恒溫恒濕箱（上海平軒科學儀器有限公司）；電子天平（常州市幸運電子設備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海鑫翁科學儀器有限公司）；微波爐（琪摩電子科技有限公司）；多功能電磁爐（深圳市龍華新區智首電器廠）；臺式離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；凈化工作臺（鄭州南北儀器設備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（濟南展康醫療器械有限公司）；振蕩培養箱（濟南銘晟醫療器械有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海慧泰儀器制造有限公司）；冰箱（松下電器（中國）有限公司）；PCR儀（BIO RAD，伯樂生命醫學產品（上海）有限公司）；穩壓穩流電泳儀（上海啟閔生物科技有限公司）；紫外透射分析儀（上虞艾科儀器設備有限公司）．

無水乙醇（開封百川匯寶實業有限公司）；羧甲基纖維素鈉（河北鵬與生物科技有限公司）；Tris，溶菌酶（Biotopped，北京博奧拓科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（牡丹江市豐達化工進出口有限責任公司）；剛果紅（湖北欣欣佳麗生物科技有限公司）；胰蛋白胨（上海振品化工有限公司）；酵母膏（武漢恩比德化工產品有限公司）；Agar（BIOSHARP，北京蘭杰柯科技有限公司）；氫氧化鈉（滄州劉氏化工有限公司）；硫酸鎂（山東騰飛生物科技有限公司）；磷酸二氫鉀（柳州市新納精細化工廠）；丙三醇（沈陽久野化工原料有限公司）；硝酸銨（昆明鹿阜商貿有限公司）；冰醋酸（山東旭晨化工科技有限公司）；溴化乙錠（Sigma，江蘇西格瑪電器有限公司）．

以廢舊報紙為唯一碳源進行搖床培養的培養液．

1.2　方法

1.2.1培養基（1）LB固體培養基．胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉7.5 g，d H2O 500 mL，pH7.0．（2）LB液體培養基．胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，NaCl 5 g，d H2O 500 mL，pH7.0．（3）篩選培養基[7]．羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）7.5 g，NH4NO30.5 g，酵母膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂粉10 g，d H2O 500 mL，pH自然．

1.2.2初篩在三角瓶中倒入200 mL蒸餾水和20個玻璃珠，再放入0.3 g報紙剪成的碎紙片．把三角瓶放置于37 ℃、180 r/min的搖床培養48 h．繼續進行10倍梯度稀釋，吸取0.1 mL稀釋樣液在LB固體培養基平板上涂布，將每個濃度梯度的平板密封做好記號后于37 ℃的恒溫恒濕培養箱里培養1～2 d．選擇單個菌落進行染色（簡單染色[8]、革蘭氏染色和芽孢染色[9]）觀察，將分離純化出的菌株接到LB液體培養基中進行培養，準備用于復篩實驗．

1.2.3復篩只有能夠把纖維素水解成單糖，并且可以利用水解纖維素生成產物的細菌才可以在以CMC-Na為唯一碳源的剛果紅培養基上生長[10-12]，利用篩選培養基篩選分離出能夠產生纖維素酶并且具有高產能力的菌株．將配置好的每200 mL CMC-Na培養基分裝到三角瓶中，封口滅菌．稱0.05 g剛果紅用于配制10 mg/mL的剛果紅溶液，取1 mL的剛果紅溶液加到200 mL的培養基中．震蕩搖勻后倒平板．取待測菌接種于LB液體培養基搖床培養活化，吸取菌液涂布后，倒置37 ℃恒溫箱中進行培養，觀察菌落外部形態特征及在培養基上產生透明圈的大小．將復篩得到的菌株接種到LB液體培養基，于37 ℃，180 r/min的搖床培養8～10 h，液體LB培養基變渾濁．將1 mL的菌液和1 mL濃度為50%滅菌后的甘油移入2 mL離心管中并震蕩，充分混合溶液．最后甘油的濃度為25%，把甘油與菌液混合均勻后放入-20 ℃冰箱進行菌種保藏[13]，為篩選得到的菌株進行分子生物學鑒定做準備．

1.3　鑒定

1.3.1形態學鑒定在細菌生長的平板上觀察菌落的特點（如顏色、外形、表面是否光滑等[14]）；簡單染色觀察細菌的形態；革蘭氏染色鑒定篩選的菌株為G+還是G-；芽孢染色看到細菌可以產生芽孢．并和初篩的染色結果對比，確定復篩得到的菌株是從以報紙為唯一營養源的報紙培養液中分離篩選出的菌株并進行初步的鑒定．

1.3.2分子生物學鑒定（1）細菌基因組16S rDNA的提取[15]．在超凈工作臺中用移液槍吸取保藏菌液800 μL，移入裝有100 mL LB液體培養基的三角瓶中，放到溫度設置為37 ℃轉數180 r/min的搖床里一直到液體中能夠看到渾濁．把細菌的16S rDNA用DNA提取試劑盒（離心柱型）提取出來．試劑盒產品組成為：緩沖液GA 15 mL，緩沖液GB 15 mL，緩沖液GD 13 mL，漂洗液PW 15 mL，洗脫緩沖液TE 15 mL，ProteinaseK 1 mL，吸附柱CB 350個，收集管（2 mL）50個．離心管中得到的溶液即為提取到的細菌16S rDNA．將得到細菌的16S rDNA放到-20 ℃的冰箱儲存．

（2）0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測[16-17]．DNA在電泳液中經過電場中的凝膠介質移向正極，DNA片段不一樣在單位時間內泳動的距離也不一樣．

①配制50*TAE緩沖液．稱Tris 2.42 g，乙二胺四乙酸二鈉0.372 g，加入8 mL蒸餾水攪拌均勻后加入0.571 mL冰乙酸，攪拌均勻后倒入蒸餾水至10 mL．在配好的50*TAE中倒入490 mL蒸餾水，稀釋為500 mL的1*TAE緩沖液后，放置一旁待需要時使用．

②配40 mL 0.8%的瓊脂糖凝膠．拿一個250 mL三角瓶，用分析天平稱0.32 g瓊脂糖，稱量40 mL的1*TAE倒在三角瓶里，再把稱好的瓊脂糖倒進去，混勻后用封口膜封上，放入微波爐中加熱，使溶液變成透明．

③制備膠板．在電泳槽一側插好梳子，等瓊脂糖凝膠液冷卻到用手摸不燙時加入1 μL 0.5 mg/mL的EB混合均勻后，慢慢地把膠液倒在制膠槽中，靜置，等膠液變成固體可以看到乳白色后，把膠上的梳子輕輕地直著拿下來．把凝膠和膠板按正確的方向放進電泳槽里并卡住膠板，在電泳槽中倒入1*TAE緩沖液直到沒過膠板．

④上樣．用移液槍吸取2份2 μL的溴酚藍，分別與5 μL Marker和DNA樣品在點樣板上混合均勻后，用移液槍按順序移到點樣孔中，每加完一個樣品要更換槍頭．

⑤電泳．把電泳槽上的線接好，打開電泳儀，電壓調到90～100 V，當藍色條帶移到距離點樣孔2 cm時，關閉電泳儀的電源．

⑥觀察．取出膠板放到紫外透射分析儀觀察后，放在成像系統觀察并拍照記錄．

（3）PCR擴增．PCR[18]后可以得到指數倍的模板DNA片段，很快就可以獲得很多的特定的基因片段．提取細菌的16S rDNA片段用作模板．PCR反應體系（25 μL）：引物1 1 μL，引物2 1 μL，DNA模板1 μL，緩沖液、4種dNTP溶液、taqDNA聚合酶、Mg2+等混合液12.5 μL，ddH2O 9.5 μL．PCR反應條件：95 ℃下預變性5 min，95 ℃變性10 s，49 ℃退火10 s，72 ℃下延伸1 min，共來回32次，最后在72 ℃下延伸5 min，到溫度下降到12 ℃時反應結束．取5 μL PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩下的PCR產物放到冰箱4 ℃保藏．檢測后取出膠板放到紫外透射分析儀觀察，并放在成像系統觀察且拍照記錄，檢測結果滿意后在哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司對擴增產物測序．

（4）菌株16S rDNA序列分析與菌株鑒定．把DNA序列粘貼到NCBI數據庫，經過Blast得到與該細菌基因序列同源性較高的序列，建立該菌株的系統發育樹[19-20]，鑒定篩選分離出的菌株．

2　結果與分析

2.1　菌株初篩結果分析

在三角瓶中倒入200 mL蒸餾水，放入20個玻璃珠后，將報紙剪成細小的碎片，并稱取0.3 g放到三角瓶中（見圖1a），把三角瓶放到37 ℃、180 r/min的搖床培養24 h后（見圖1b），培養48 h后（見圖1c），觀察效果．由圖1b～c可見，培養48 h后的培養液顏色明顯比培養24 h后的培養液顏色變淺．由此可以得出，以報紙為唯一碳源的培養液中存在具有脫墨作用的微生物．

圖1　報紙紙漿不同培養時間效果

取報紙培養液稀釋，涂布到LB固體培養基長出不同形態菌落（見圖2a），選擇一個長得好的單菌落，把它用接種環挑出來一點，然后在LB固體培養基平板上劃線，培養后得到的細菌在LB固體培養基上生長情況（見圖2b）．

圖2 報紙培養液中分離脫墨細菌生長形態

用接種環挑取圖2b中的單個菌落進行染色（見圖3）．由圖3可見，篩選出的為短桿狀菌體，革蘭氏染色把菌體染為紫色（見圖3b），說明該菌為G+，芽孢染色后看到芽孢被染成綠色，菌體被染成紅色（見圖3c），說明篩選出的細菌能夠產生芽孢．

圖3　不同染色方法的初篩效果

2.2　菌株復篩結果分析

吸取初篩的菌株保藏的菌液，移入LB液體培養基搖床培養活化后，用移液槍吸取菌液滴到以CMC-Na為唯一碳源的剛果紅培養基上涂布后，倒著放到培養箱里培養，細菌生長結果見圖4．篩選出的菌株可以在以CMC-Na為唯一碳源的剛果紅培養基平板上生長并能產生透明圈，說明這個細菌是能夠產纖維素酶并且具有高產能力的菌株．

2.3　菌株的鑒定

2.3.1菌株的形態學鑒定選擇復篩平板上生長的一個單菌落，用接種環挑一點細菌放到LB液體培養基中，然后放到37 ℃、180 r/min的搖床里培養，等三角瓶中的液體能看到混濁后，取菌液涂布在LB固體培養基平板上．放到37 ℃的恒溫恒濕培養箱培養12 h后，可以看到菌落的外沿呈現出乳白色，中間為粉紅色，菌落表面比較粗糙（見圖5）．

圖4　菌株復篩結果

圖5　復篩培養12 h菌落

對待鑒定的菌落進行染色（見圖6），并放到顯微鏡下觀察，在低倍鏡下找到視野后再調換到油鏡觀察．

圖6　不同染色方法的復篩效果

通過染色觀察比較，鑒定的菌株與初篩的菌株是一樣的，菌體全為短桿狀，用革蘭氏染色法染色后，菌體呈紫色（見圖6b），表明這個菌為G+，芽孢染色觀察到芽孢為綠色，菌體為紅色（見圖6c），說明該菌產芽孢，暫且將此菌株命名為QQ1128.1．

2.3.2菌株的分子生物學鑒定將提取的細菌16Sr DNA進行瓊脂糖凝膠電泳后，放到電子成像系統下觀察，電泳結果見圖7．

把QQ1128.1的DNA作為模板進行PCR擴增，電泳檢測PCR產物，觀察電泳結果，得到的DNA片段長度約1 500 bp（見圖8）．

圖7　細菌16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳電子成像

注：1. Maker DL2000；2. QQ1128.1的16Sr DNA．

圖8　電泳檢測QQ1128.1的DNA作為模板進行PCR擴增產物

注：1. Maker DL2000；2. CK；3. QQ1128.1的16Sr DNA的PCR擴增產物．

在哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司對PCR產物測序后，測得PCR擴增產物條帶長度為1 049 bp，核苷酸序列為：GGGCGTCGTGCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGGTTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGGGGAAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTCCTCTGACATCCCTAAAGATAGGACGTCCCTTTCGGGGCAAAATGACAGGGGGTTCATGGTTGTCCCCACTTCGGGCC．

圖9　BioEdit軟件打開序列

將序列用BioEdit軟件打開（見圖9），由圖9可見，序列無雙峰和底峰，說明所用引物和模板較純．

2.3.3構建系統發育樹把DNA序列粘貼到NCBI數據庫中，經過Blast得到QQ1128.1基因組序列（見圖10），發現QQ1128.1與枯草芽孢桿菌同源性最高，達98.43%．

圖10　Blast得到QQ1128.1基因組序列

選擇5個和QQ1128.1最可能是從共同祖先經過進化后成為不同序列的菌株，下載這5個菌株的序列，用clustal X軟件對序列進行比較后，用MEGA 4軟件建系統發育樹（見圖11），鑒定QQ1128.1為芽孢桿菌屬的一個新種．

圖11　MEGA 4軟件建系統發育樹

3　結論

以報紙為唯一營養源的培養液中存在具有脫墨作用的微生物，從培養液中經過初篩和復篩得到一株產纖維素酶的高產菌株并命名為QQ1128.1．通過對該菌的形態學鑒定和分子生物學鑒定并構建系統發育樹，鑒定QQ1128.1為芽孢桿菌屬的一個新種．

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Identification and study of high cellulase producing strains isolated from waste newspapers

CAO Zhe1，YAN Yaqingying1，YU Jingyi1，WU Lingyan1，LU Wanting1，YU Xinyue1，XU Jialu2，ZHENG Miaomiao1

（1. School of Food Engineering，Harbin Institute，Harbin 150001，China；2. School of Dentistry，Harbin Medical University，Harbin 150001，China）

Currently，the paper industry is the industry that consumes the largest amount of forest resources，and the amount of wood consumed for paper making is huge every year．Pretreated waste newspaper pulp was used as raw material to screen cellulase producing strains under certain conditions and applied to the study of deinking of waste paper pulp．The effects of concentration，time and temperature on the isolation of high cellulase producing strains from waste newspaper were investigated，and the strains were identified by simple staining，Gram staining and Congo plate method．The results showed that a short rod-shaped Gram-positive strain with budding spores was isolated and purified from the culture solution by shaking bed culture using newspaper as the only nutrient source．Using sodium carboxymethyl cellulose as the sole carbon source，a cellulase producing strain with high capacity was finally screened and named QQ1128.1．16S rDNA was extracted，and after PCR amplification and sequence sequencing，a phylogenetic tree was constructed to identify the bacterium QQ1128.1 as a new species of the．The deinked strain obtained can improve the effective use of renewable resources，realize the construction of national ecological civilization．

cellulase；16S rDNA；screening；identification

1007-9831（2022）08-0063-08

Q55

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.013

2022-04-18

黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目（202210234018）；哈爾濱學院青年博士科研啟動基金項目（HUDF2019103）；黑龍江省博士后資助經費項目（LBH-Z18028）

曹哲（2000-），男，山西大同人，在讀本科生．E-mail：1491514846@qq.com

鄭苗苗（1982-），女，黑龍江哈爾濱人，教授，博土，從事應用微生物研究．E-mail：miaomiao_0000@126.com