水解蛋白酶ZL-1在飼料魚溶漿中的酶解應用

王春曉，郝李振，李旦旦，肖靜

水解蛋白酶ZL-1在飼料魚溶漿中的酶解應用

王春曉1，郝李振1，李旦旦1，肖靜2

（1. 濟南正隆生物科技有限公司，山東 濟南 250109；2. 齊魯工業大學（山東省科學院） 生物工程學院，山東 濟南 250353）

魚溶漿是魚粉加工副產物，富含蛋白，漿液粘度大．酶解加工魚溶漿有利于將大分子蛋白質水解成肽和氨基酸等，降低漿液粘度，從而提高魚溶漿的營養性及加工運輸性．采用單因素實驗和正交實驗分析法系統研究并優化了利用ZL-1酶解魚溶漿的工藝條件．得到的最佳酶解條件為：漿料濃度為10%，溫度為55 ℃，不調節pH，ZL-1的加酶量為0.75%干物質濃度，酶解時間為2 h．最佳的工藝實驗條件的驗證結果表明，水解液中的氨基氮含量比優化前提升了129.47%，粘度降低了84.83%，用酶處理魚溶漿顯著增加了其流動性．

魚溶漿；酶解；氨基氮

魚粉是目前水產飼料不可或缺的重要原材料之一，是水產動物重要的蛋白來源[1-2]．由于鮮魚的含水量約占75%[3]，在魚粉的制作過程中，大量的水溶性物質在蒸煮、壓榨后分體形成液體，這些液體即為魚溶漿[4-5]．

Ahmad[6]等研究了魚溶漿對大豆濃縮蛋白的增塑和結合作用，證實了魚溶漿在魚飼料擠出過程中用作增塑劑和粘合劑的潛力．Espe[7]等發現向大西洋鮭（）基于植物蛋白的日糧中添加魚溶漿，并不會影響其自愿采食量和改善其生長．我國魚粉年產量30多萬t，每生產1 t魚粉，大約產生2～3 t榨汁[8]，早期魚粉生產工藝過程中，這些榨汁通常不經過回收直接向環境中排放，造成嚴重的環境污染[9-10]．在魚飼料中添加魚溶漿代替魚粉，可有效節約魚粉，緩解魚粉生產過程中的環境污染問題，并有促進魚體生長的作用．周露陽[11]等的研究報道，在黃顙魚（）日糧中添加8.5%的酶解魚溶漿可完全替代28%的魚粉，且酶解魚溶漿促生長效果優于魚溶漿．經研究發現，魚溶漿含有大量的小分子多肽、氨基酸、牛磺酸以及礦物質等有益成分，保留了魚粉特有的未知生長因子[12]，對水產、畜禽養殖動物具有很好的誘食和促生長作用，是很好的優質動物蛋白源、誘食劑和營養補充劑[13-14]．傳統的魚溶漿要經過加工濃縮后進行售賣，但這些魚溶漿還含有較多的大分子蛋白質，如膠原蛋白、蛋白胨等[15]，導致物料粘稠，降低了養殖動物的消化利用率．通過加工和酶解處理可以將魚溶漿中的大分子蛋白質水解成小分子多肽和游離氨基酸，這樣不僅可以提高其流動性，還能增加吸收利用率[16-18]．因此，將魚溶漿經過酶解處理可以進一步地拓展魚溶漿的應用范圍．

近年來，越來越多的生產企業嘗試通過酶處理魚溶漿，提高其利用效率，將其作為替代魚粉，用作飼料添加劑的最優原料選擇[19-20]．為了更好地適應行業需求，結合實際工藝，將酶解魚溶漿的工藝條件進行優化處理，以酶解液黏度和氨基氮含量作為評價指標，為優質低廉魚溶漿的開發利用提供較好的途徑和方法．

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

HT1150ATC型折光儀（鄭州南北儀器設備有限公司）；5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；UV-6100型熒光分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）；NDJ-5S型數字式黏度計（上海衡平儀器儀表廠）；YP6102型電子天平（上海光正醫療儀器有限公司）；HH-4型恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）．

魚溶漿（煙臺某水產公司）；堿性蛋白酶，中性蛋白酶，菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶（山東隆科特酶制劑有限公司）；魚溶漿水解蛋白酶ZL-1，ZL-2（實驗室研發自配）；甘氨酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，水合茚三酮，果糖，碘酸鉀，無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；去離子水（實驗室自制）．

1.2　實驗方法

1.2.1正交實驗設計取相同量的魚溶漿（干物質濃度為20%），分別加入相應酶活力的ZL-1、ZL-2、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，于55 ℃恒溫水浴中分別酶解2 h．酶解結束后，將樣品放置90℃水浴中10 min，使酶失活，通過茚三酮比色素法分別檢測酶解后溶解中的氨基氮含量．在多種蛋白酶理論最適條件下進行酶解，確定酶解時間，根據測定酶解液的游離氨基氮含量變化為指標確定各蛋白酶的酶解效果．一般以酶解液黏度為檢測指標，進行單因素酶解預實驗，選定蛋白酶的正交實驗因素水平[21]，在單因素實驗的基礎上，以酶解液的粘度為指標進行實驗，每個因素選擇溫度、漿料濃度和加酶量等3個因素，并設置3個水平，進行L9（33）正交實驗[22]．對正交實驗結果進行方差和回歸分析，從而得出最優的酶解條件組合，并進行實驗驗證．實驗重復3次，實驗結果為測定結果的平均值．

1.2.2原料處理將原魚溶漿（干物質濃度55%左右）按照各實驗需求稀釋至相應的漿料濃度，分裝，并按實驗方案添加相應的酶．水浴溫度和時間按相應的實驗方案安排．酶解完成后取酶解后1/2的魚溶漿加熱蒸煮酶解液進行濃縮，使用折光儀檢測濃縮后漿料干物質濃度至50%[23]，室溫靜置過夜后檢測濃縮后漿料的粘性；取另1/2酶解后的魚溶漿通過6 000 r/min離心3 min，收集上清液，檢測游離氨基氮含量．

1.2.3黏性檢測使用數字式粘度計檢測濃縮酶解液粘度，設置檢測參數為：轉子3，測速60 r/min，溫度為22℃．

1.2.4氨基氮測定方法氨基氮含量的測定采用茚三酮比色法[24]．魚溶漿蛋白肽的相對分子質量分布及占比、酸溶蛋白氮含量參考國標《GB/T 22729—2008海洋魚低聚肽粉》中的方法．

1.3　數據分析

采用OriginPro8.5，SPASS8.1，DPS1.0統計軟件對數據進行分析處理及圖表制作，方差分析的顯著性水平為<0.05．

2　結果分析與討論

2.1　蛋白酶的選擇

不同酶對魚溶漿中氨基氮含量變化的影響見圖1．由圖1可見，在其它酶解條件相同的情況下，在魚溶漿中加入等量的不同種類的蛋白酶，酶解2 h后，不同蛋白酶對魚溶漿酶解后產生的氨基氮含量不同．與空白對照相比，酶解液中氨基氮含量最高的是ZL-1，為6 259.0 mg/L，其次是堿性蛋白酶、胰蛋白酶和ZL-2，分別為5 333.2，4 971.0，4 841 mg/L．而菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶對魚溶漿具有一定的酶解作用，但酶解效果相對較差．綜合實驗結果，最終選擇氨基氮含量最高的ZL-1進行魚溶漿酶解條件優化．

2.2　酶解條件的單因素實驗結果

2.2.1溫度的影響漿料濃度設置為20%，將漿料添加0.5%的ZL-1，分別于40，45，50，55，60，65，70，75，80 ℃的恒溫水浴中酶解2 h，將酶解液加熱濃縮至干物質濃度為50%，檢測酶解液粘性．酶解魚溶漿的粘性隨酶解溫度的變化趨勢見圖2．

圖1　不同酶對魚溶漿中氨基氮含量變化的影響

圖2　溫度對魚溶漿粘度的影響

注；不同字母表示組間差異顯著（＜0.05），下同．

由圖2可見，在其它酶解條件相同的情況下，改變酶解的溫度對魚溶漿的粘度有顯著影響，隨著恒溫溫度的不斷增加，酶解后的魚溶漿粘度呈先降低后升高的變化趨勢．當溫度在55～65 ℃時，粘度趨于平緩，并在55 ℃時達到最低，為162.1 mPa·s，但溫度高于65 ℃時，酶的活性受到溫度的影響較大，對魚溶漿的酶解受到影響，因此酶解的魚溶漿粘度升高．最終確定酶解的最佳溫度為55～65 ℃．

2.2.2加酶量的影響漿料濃度設置為20%，在漿料中分別添加0.25%，0.5%，0.75%，1%，1.25%的ZL-1，于55℃恒溫水浴中酶解2 h，將酶解液加熱濃縮至干物質濃度為50%，檢測酶解液粘性．酶解魚溶漿的粘性隨ZL-1用量增加的變化趨勢見圖3．

由圖3可見，ZL-1的用量對魚溶漿的粘度具有顯著影響，隨著加酶量的增加，其粘度逐漸降低．當加酶量為0.2%時，漿料的粘度最大，為375.5 mPa·s，繼續增加用酶量，粘度快速降低，酶解液的粘度隨加酶量增加呈現顯著降低趨勢；當用酶量為1.25%時，魚溶漿的粘度最低，為152.0 mPa·s．當魚溶漿的底物充足時，增加用酶量可以促進魚溶漿的酶解，增加魚溶漿的流動性．但是酶解底物的質量是有限的，過量添加的ZL-1無法繼續再將魚溶漿酶解，當加酶量從0.5%逐漸增加到1.25%時，粘度趨于平緩，因此確定魚溶漿酶解的適宜用酶量為0.5%～0.75%．

2.2.3漿料濃度的影響將干物質濃度為55%的原漿料稀釋為10%，15%，20%，25%，30%，分別在其中加入0.5%的ZL-1，55℃恒溫水浴中酶解2 h，將酶解魚溶漿經過加熱濃縮到干物質為50%后，檢測其粘性．酶解液的粘性隨漿料濃度增加的變化趨勢見圖4．

由圖4可見，同樣的酶解條件下，初始酶解漿料濃度對酶解后的魚溶漿粘度具有顯著影響，隨著漿料濃度的增加，酶解后的魚溶漿粘度逐漸升高．當漿料濃度為10%時，酶解魚溶漿的粘度最低，為160.3 mPa·s，隨著漿料濃度的增加，酶解后的魚溶漿粘度逐漸增加．結合實際生產需求，最佳的酶解漿料濃度可為10%～30%．

圖3　加酶量對魚溶漿粘度的影響

圖4　漿料濃度對粘度的影響

2.3　酶解工藝正交實驗結果

酶解工藝參數優化的正交實驗設計及結果見表1．由方差分析可知，酶解溫度、漿料濃度、加酶量對粘度均具有顯著的影響（<0.05）．對水解度的影響為：漿料濃度>酶解溫度>加酶量．經過極差分析可知，經過L9（33）正交實驗后，得到ZL-1的酶解最優組合條件為：A1B1C3，即酶解漿料濃度為10%，加酶量為0.75%，酶解溫度55℃．

表1　正交實驗設計及結果

2.4　最優組合條件驗證

選取干物質含量為55%的原魚溶漿稀釋至濃度為10%，加入0.75%的ZL-1，于55℃恒溫水浴中水解2 h，然后滅酶處理檢測的氨基氮含量，濃縮后測得酶解液的粘度與未做酶處理的魚溶漿的對比（見表2）．

表2　酶解后各項檢測指標的變化

由表2可見，使用理論最優條件組合進行魚溶漿的酶解，其粘度低于正交實驗中所有的粘度值，相較未酶解處理的魚溶漿粘度降低了84.83%，顯著增加了魚溶漿的流動性．酶解后的魚溶漿氨基氮含量升高了129.47%，表明ZL-1可以有效將魚溶漿中的大分子蛋白酶酶解成游離的氨基酸、多肽等物質．

2.5　酶解工藝在其它物理量上應用

將ZL-1的最佳酶解工藝用于蛋白酶酶解效果較好的堿性蛋白酶、胰蛋白酶、ZL-2上，分別檢驗酸溶蛋白氮含量、分子量占比及口感，結果見表3．

表3　其它物理量的對比應用結果

由表3可見，胰蛋白酶的酸溶蛋白氮含量最高，ZL-1次之，與胰蛋白酶相差不大；在＜500 Da的分子量占比中，ZL-1酶解后的魚溶漿占100%，平均分子量192.56 Da；在口感上ZL-1、ZL-2的口感較為突出．經過綜合比較發現，ZL-1在綜合考量下，酶解魚溶漿的效果最好．

3　結論

（1）以游離氨基氮的含量為檢測指標，對多種蛋白酶魚溶漿進行酶解，ZL-1酶解后的氨基氮含量最高，為最佳用酶選擇．

（2）通過單因素實驗和正交實驗相結合的方法優化得到ZL-1酶解魚溶漿的酶解工藝參數．ZL-1最佳酶解條件為：酶解漿料濃度為10%，酶解溫度為55℃，加酶量為0.75%，酶解時間為2 h．在此條件下進行魚溶漿的酶解，可得到濃縮后酶解液的粘度為152.3 m Pa·s，相較于未酶解處理的魚溶漿粘度降低了84.83%，很大程度上增加了魚溶漿的流動性，酶解后魚溶漿中游離氨基氮含量也增加了129.47%．

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The enzymatic application of hydrolytic protease ZL-1 in feed fish slurry

WANG Chunxiao1，HAO Lizhen1，LI Dandan1，XIAO Jing2

（1. Jinan Zhenglong Biological-Tech Co.，Jinan 250109，China；2. School of Bioengineering，Qilu University of Technology（Shandong Academy of Sciences），Jinan 250353，China）

Fish slurry is a by-product of fish meal processing，rich in protein and with a high viscosity．The enzymatic processing of fish slurry facilitates the hydrolysis of large molecules of protein into peptides and amino acids etc，which reduces the viscosity of the slurry，thereby improving its nutritional and processing transportability．The process conditions for the enzymatic digestion of fish slurry using ZL-1 were systematically investigated and optimised using single factor tests and orthogonal analysis．The optimum enzymatic conditions were obtained as follows，slurry concentration of 10%，temperature of 55 ℃，no pH adjustment，enzyme addition of ZL-1 at 0.75% dry matter concentration and enzymatic digestion time of 2 h．The validation of the optimum process conditions showed that the amino nitrogen content of the hydrolysate increased by 129.47% compared to the pre-optimisation period．The viscosity was reduced by 84.83% and the treatment of fish slurry with enzymes significantly increased their fluidity．

fish slurry；enzymatic；amino nitrogen

1007-9831（2022）08-0077-05

Q93

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.015

2022-05-06

王春曉（1990-），女，山東高密人，中級實驗師，碩士，從事食品酶應用研發研究．E-mail：jnyfzx002@163.com

肖靜（1974-），女，山東泰安人，教授，博士，從事酶制劑應用研究．E-mail：xiaojing8168@163.com