熱活化延遲熒光納米探針制備及其時(shí)間分辨成像研究

李海洋，傅妮娜（通訊作者）

（南京郵電大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇 南京 210023）

0 引言

熒光成像（FI）在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷方面表現(xiàn)出諸多優(yōu)秀特質(zhì)，例如：非侵入性、時(shí)空分辨率高、成像速度快、靈敏度高、費(fèi)用低廉、無(wú)電離輻射等；可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體內(nèi)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成及抗腫瘤藥物治療等進(jìn)行實(shí)時(shí)的特異性跟蹤和探測(cè)，從分子、細(xì)胞水平上研究腫瘤內(nèi)發(fā)生的一系列生理、病理學(xué)變化[1-2]。光學(xué)影像和傳感技術(shù)的核心是熒光探針。

近年來(lái)，具有熱致延遲熒光（TADF）性質(zhì)的熒光發(fā)光體逐漸被用于熒光和時(shí)間分辨雙模成像[3]。全有機(jī)TADF材料表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光發(fā)射（光吸收強(qiáng)、發(fā)光效率高、光穩(wěn)定性好）[4-6]和生物相容性。宋鋒玲等[3]研究小組最先開(kāi)展基于熱致延遲熒光分子的時(shí)間分辨成像（FLIM），例如，將全有機(jī)TADF小分子CPy制備成水溶性納米顆粒后應(yīng)用到生物成像中的獨(dú)特性，該納米顆粒既實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨熒光成像應(yīng)用，又兼具無(wú)官能化細(xì)胞膜標(biāo)記特性。本文設(shè)計(jì)合成的帶叔丁基的TADF分子（tBu-CPy），以高密度的叔丁基提高其激發(fā)態(tài)壽命，通過(guò)納米再沉淀的方法制備由兩親性聚合物DSPE-PEG2000包覆的水溶性的納米顆粒（tBu-CPy NPs），見(jiàn)圖1。tBu-CPy NPs具有熒光量子產(chǎn)量高和熒光壽命長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，能有效實(shí)現(xiàn)對(duì)Hela細(xì)胞膜的長(zhǎng)效標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)激光共聚焦熒光顯微成像和熒光壽命成像，以雙模成像的方式有效避免細(xì)胞自發(fā)光對(duì)影像信號(hào)的干擾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品與表征測(cè)試方法

本文中使用的3，6-二叔丁基咔唑，四氟氰基吡啶購(gòu)自寧波盧米藍(lán)新材料有限公司，碳酸鉀、二甲亞砜（DMSO）等化學(xué)試劑均為純度98%以上商業(yè)化原料。表征測(cè)試儀器包括：核磁共振波譜儀（JNM-ECZ400S/L1，JOEL），MALDI-TOF 質(zhì)譜儀（Autoflex Speed，Bruker），紫外可見(jiàn)風(fēng)光光度計(jì)（UV-1750,Shimadzu），熒光光譜儀（F4600, HITACHI），熒光顯微鏡（Olympas D-70，Park）等。核磁共振波譜：1H NMR使用 JNM-ECZ400S/L1型核磁共振波譜儀測(cè)試。以四甲基硅烷（TMS，δ=0 ppm）作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，根據(jù)樣品特性選擇氘代氯仿（CHCl3-d）進(jìn)行測(cè)試?；|(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）：使用1，8，9-三羥基蒽為電離基質(zhì)，在 Bruker AutoflexⅡ型質(zhì)譜儀上測(cè)試。

1.2 材料合成及表征

1.2.1 tBu-CPy合成

在干燥的兩口瓶（100 mL）中，加入2，3，5，6-四氟-4-氰基吡啶（352 mg，2 mmol）、3，6-二叔丁基咔唑（2.69 g，4.8 mmol）、無(wú)水碳酸鉀（1.92 g，14 mmol），用真空泵抽真空、連通氮?dú)庵脫Q3次。以注射器加入DMSO（25 mL），在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，油浴鍋中加熱到145 ℃，攪拌15～30 min，薄層色譜監(jiān)控發(fā)現(xiàn)反應(yīng)完成。降溫后，在反應(yīng)體系中加純凈水，大量黃綠色沉淀生成，過(guò)濾后，對(duì)濾餅干法上樣，硅膠色譜柱分離得tBu-CPy固體粉末。柱層析產(chǎn)物以甲醇和乙酸乙酯重結(jié)晶得到純產(chǎn)物是1.85 g，產(chǎn)率76.3%。1H NMR（400 MHz,CDCl3）δ=7.63(s,4H），7.58（s,4H），7.17（s,4H），7.06（d,4H），6.98（d,4H），6.92（d,4H），1.36（m,72H）ppm。13C NMR（101 MHz,CDCl3）δ=155.81，141.30，139.36，137.32，136.56，129.06,126.52，121.06，120.71，114.77，55.59，28.55，24.26 ppm.MALDI-TOF-MS（m/z）:Calculated for C86H96N6:1212.7696；Found:1213.7684[M]+。

1.2.2 tBu-CPy NPs 制備

稱(chēng)取tBu-CPy（1 mg）和DSPE-PEG2000（2 mg），在THF（2 mL）中充分混勻，快速加入到10 mL的超純水溶液中，同時(shí)在超聲儀器中超聲6～8 min，得到澄清的溶液。向其中加入大小合適的磁子，氮?dú)馇虮Ｗo(hù)下在磁力攪拌器上室溫下攪拌24 h。24 h后停止攪拌，以0.22 μm的水相過(guò)濾頭過(guò)濾，得到DSPE-PEG2000包覆的tBu-CPy納米顆粒澄清水溶液。該tBu-CPy納米顆粒水溶液的濃度約為8.3×10-5M，標(biāo)記為tBu-CPy NPs。

1.2.3 tBu-CPy納米顆粒共聚焦成像

將凍干的tBu-CPy NPs溶解在DMEM培養(yǎng)基中（8 μM）與Hela 細(xì)胞共孵育。利用激光共聚焦熒光成像，研究該納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的熒光標(biāo)記行為；同時(shí)，利用共聚焦熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）來(lái)探究tBu-CPy NPs在癌細(xì)胞中時(shí)間分辨成像能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 tBu-CPy及tBu-CPy NPs的光物理性質(zhì)

等濃度情況下所測(cè)試tBu-CPy（THF溶液）和tBu-CPy NPs（水溶液）的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。tBu-CPy和tBu-CPy NPs在各自溶液中的最強(qiáng)吸收峰均在280～370 nm，這屬于tBu-CPy分子共軛骨架結(jié)構(gòu)中的π-π*的躍遷；在450～470 nm之間的寬吸收峰是其分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移態(tài)躍遷對(duì)應(yīng)的吸收信號(hào)。tBu-CPy和tBu-CPy NPs具有非常相似的光吸收特性，僅后者較前者略微紅移，表明大量叔丁基存在并未能完全抑制分子直接的堆積和π-π相互作用。tBu-CPy和tBu-CPy NPs的熒光最大發(fā)射峰分別出現(xiàn)在532 nm和547 nm處，后者相對(duì)前者略紅移15 nm?？梢钥闯鰧Py制備成納米顆粒時(shí)，tBu-CPy分子在聚集時(shí)熒光并不會(huì)發(fā)生淬滅，基于tBu-CPy的納米粒子在生物細(xì)胞成像具有很好的應(yīng)用前景。tBu-CPy NPs熒光發(fā)射峰強(qiáng)略弱于tBu-CPy在THF的發(fā)射，但依然保持高發(fā)光效率，表明聚集并未嚴(yán)重淬滅tBu-CPy的熒光發(fā)射。tBu-CPy NPs具有的深綠色光發(fā)射（547 nm），可以有效避免細(xì)胞基質(zhì)自身的藍(lán)光的影響。此外，tBu-CPy NPs的斯托克位移也較大，可有效避免入射光對(duì)熒光信號(hào)的干擾[7]，這些特性有利于tBu-CPy NPs作為高效的共聚焦熒光成像納米探針。

為驗(yàn)證tBu-CPy NPs在光輻照條件下的穩(wěn)定性，對(duì)其進(jìn)行持續(xù)光照，記錄其熒光發(fā)光強(qiáng)度變化。tBu-CPy NPs在 2 W/cm2白光光源持續(xù)照射，其中tBu-CPy NPs的濃度為6.0×10-6M，每隔5 min測(cè)一次熒光光譜，每次白光照射10 min。如圖3所示，tBu-CPy NPs在較強(qiáng)光照下的熒光穩(wěn)定性較好，持續(xù)90 min較大功率白光照射，其熒光強(qiáng)度衰減率僅為其熒光強(qiáng)度的3.5%。這表明tBu-CPy NPs在較低功率的激光共聚焦顯微鏡下，進(jìn)行細(xì)胞成像測(cè)試時(shí)，其光穩(wěn)定性能夠保持，所受光照的影響較小，有利于長(zhǎng)時(shí)間跟蹤的熒光成像。

對(duì)tBu-CPy納米顆粒樣品測(cè)試量子效率和熒光壽命時(shí)間，室溫、氮?dú)夥障聹y(cè)試的熒光衰減曲線見(jiàn)圖4。對(duì)圖4曲線進(jìn)行擬合，可知tBu-CPy納米顆粒熒光壽命在3.6 μs左右，此數(shù)值遠(yuǎn)高于細(xì)胞基質(zhì)常見(jiàn)組分幾到十幾納秒的短壽命，表明tBu-CPy NPs可以作為時(shí)間分辨成像探針，對(duì)細(xì)胞或生物組織進(jìn)行熒光壽命成像。由插入的小圖可知，tBu-CPy納米顆粒在透射電子顯微鏡（TEM）圖像呈球形，直徑為50 nm左右，粒徑分布較為均一。對(duì)tBu-CPy NPs水溶液反復(fù)凍干、溶解后，發(fā)現(xiàn)tBu-CPy NPs始終能夠保持非常好的溶解性和粒徑分布穩(wěn)定性。此外，對(duì)tBu-CPy NPs進(jìn)行儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其能在4 ℃冰箱和氮?dú)鈿夥障卤３?個(gè)月以上，其熒光強(qiáng)度幾乎不變，以上研究均表明tBu-CPy NPs具有非常高的光穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

2.2 tBu-Cpy NPs在癌細(xì)胞中熒光成像的探究

由于tBu-CPy NPs具有良好的光穩(wěn)定性以及較好的分散性和熒光發(fā)光壽命長(zhǎng)的特性，將其作為熒光成像納米探針應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的共聚焦顯微成像。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證tBu-CPy NPs對(duì)細(xì)胞活性的測(cè)試實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖5。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，將不同濃度的tBu-CPy NPs與Hela細(xì)胞孵育培養(yǎng)24 h，探究Hela細(xì)胞的活性，其成活率均為80%以上；同等測(cè)試條件下，tBu-CPy NPs染色的Hela細(xì)胞，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，其成活率均為70%以上。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明tBu-CPy NPs在達(dá)到80 μmol濃度級(jí)別時(shí)仍具有極低的毒性和良好的生物相容性。

圖6是濃度為8.3 μM的tBu-CPy NPs孵育Hela細(xì)胞2 h后，利用激光共聚焦顯微鏡激光器照射60 min后，激光共聚焦熒光顯微鏡所測(cè)的細(xì)胞成像結(jié)果。如圖6(a)所示，用tBu-CPy NPs孵育Hela細(xì)胞后，細(xì)胞膜上的熒光發(fā)射強(qiáng)度均高于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，表明tBu-CPy NPs具有典型的細(xì)胞膜靶向特性。造成這一結(jié)果的主要原因是tBu-CPy分子中大量叔丁基存在，有利于其脂溶性，當(dāng)tBu-CPy NPs進(jìn)入Hela細(xì)胞后，包裹的DSPE-PEG2000與tBu-CPy分子分散，引起部分tBu-CPy嵌入細(xì)胞磷脂雙分子層膜中[7-8]。利用405 nm激光器對(duì)經(jīng)tBu-CPy NPs孵育Hela細(xì)胞進(jìn)行熒光壽命（FLIM）共聚焦成像，見(jiàn)圖6(d)。細(xì)胞大部分膜上以及少部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)來(lái)自tBu-CPy NPs的長(zhǎng)壽命（數(shù)百納秒）信號(hào)。此外，熒光壽命成像結(jié)果進(jìn)一步證明，tBu-CPy NPs主要對(duì)Hela細(xì)胞膜而非細(xì)胞質(zhì)染色定位。這一結(jié)果也證明了tBu-CPy NPs可以被用來(lái)進(jìn)行Hela細(xì)胞膜標(biāo)記的時(shí)間分辨成像。

3 結(jié)語(yǔ)

本文通過(guò)無(wú)催化劑方法，“一步法”高產(chǎn)率合成全有機(jī)熱活化延遲熒光分子tBu-Cpy，并制備高穩(wěn)定性的黃綠光發(fā)射的長(zhǎng)壽命納米探針 tBu-CPy NPs。熒光共聚焦顯微成像和時(shí)間分辨成像研究表明，tBu-CPy NPs不僅能在無(wú)特殊修飾情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)Hela細(xì)胞膜靶向，同時(shí)能實(shí)現(xiàn)高效的熒光和時(shí)間分辨雙模成像。這一研究對(duì)更大范圍的高效熱活化延遲熒光分子應(yīng)用于生物成像提供基礎(chǔ)參考。