海南銅鼓嶺熱帶季雨矮林樹干附生地衣及其內生真菌多樣性的研究

李英英 鄭云柯 王祝年

（1.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571101；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 海南?？?571101）

銅鼓嶺國家級自然保護區位于海南島東北部的 文 昌 市 內 ， 地 理 坐 標 為 E 110°58′30″～111°03′00″，N 19°36′54″～19°41′21″，保護區總面積為44 km2，其中陸地面積為13.33 km2，海域面積為30.67 km2，核心區500 hm2。銅鼓嶺保護區屬于熱帶海洋性島嶼季風氣候區，具有全年無霜、雨量充沛、干濕季節分明、日照充足等特點；年平均氣溫23.9℃，全年日照時數為2 137 h，年均降雨量為1 721.6 mm，年均蒸發量為1 872.7 mm。東北風為該區常年的主導風向，年平均風速為2.8 m/s；東南向波浪為常波浪，海域風浪常以 3級風浪為主。銅鼓嶺保護區土壤以磚紅壤為主，其土層淺薄，土壤發育程度相對較低；迎海面土壤較為濕潤，背海面巖石的裸露面積大，土壤含水量較低；水系不發達，由于山區面積較小、坡度大、土層薄，集水條件差，因此銅鼓嶺山地沖溝多為干涸或間歇溝，且東西向多呈平行并近似垂直于山體走向分布，地表經流分別向東注入南海，向西流入堆積平原[1]。銅鼓嶺的水熱氣候因素為該區植被的生長發育提供了有利條件，保護區內植被茂密，植物資源豐富；由于受到海陸風和海潮的影響，銅鼓嶺地區的植被呈明顯的垂直分布和水平分布規律，植被類型隨著海拔和階地、坡向的不同，有很大的區別。從濱海沼澤、沙灘、階地至山麓和丘陵依次分布有濱海沙生植被、山麓灌木林、紅樹林、熱帶常綠季雨矮林及局部人工栽培的人工林等植被類型，其中頂級植被類型為熱帶常綠季雨矮林[2-5]。基于銅鼓嶺自然保護區內熱帶季雨矮林的特殊性，較多的學者對該森林生態系統開展研究，但截至目前，尚未發現針對該保護區內地衣多樣性的相關研究，本次調查彌補了該區地衣相關研究的空白。

地衣是一類由真菌和綠藻或藍細菌組成的可進行無性或有性繁殖的共生生物體，而此類與特定的藻類或藍細菌處于穩定共生聯合狀態的?；哉婢谛纬傻牡匾鹿采w中占據重要優勢地位；真菌是地衣體的主要成員，它決定了地衣體的形態結構特征，且地衣的有性生殖過程就是真菌的生殖過程，所以地衣又稱為地衣型真菌(lichenied fungi)[6]。構成地衣的真菌稱為地衣型真菌，而生長于地衣菌絲體內的非地衣型真菌也是一個龐大的類群，此類真菌被稱為地衣內生真菌（endolichenic fungi）[7]。內生真菌是指在其自身生活史中的某一個階段存在于健康的植物組織內部，但不會引起宿主明顯病癥或不會對宿主造成明顯傷害的真菌[8]。地衣是森林生態系統中附生生物的重要組成部分，不僅能維持森林生態系統中物種的多樣性和完整性，對于林中環境的變化也具有檢測能力；另外，由于地衣耐寒、耐旱，且對生境的營養成分要求不高，所以分布十分廣泛。與此同時，作為先鋒植物的地衣，在森林群落原生演替過程中，對于土壤的形成和群落中環境條件的改善也起著至關重要的作用[9]。

本次考察對保護區內森林群落中重要值排名前 20的相關樹種[10]樹干上附生地衣進行采集，并通過分子生物學技術對地衣及其內生真菌進行分類學鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

對銅鼓嶺自然保護區內重要值前 20的樹種（表1）進行樹干附生地衣的采樣，共采集地衣樣品252份。

表1 熱帶季雨矮林重要值前20的樹種名錄

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴增利用改良的 CTAB法[11]提取地衣的總DNA，以通用引物ITS1F(5‘-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’)和 ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)對真菌的 rDNA ITS區段進行PCR擴增[12]。

PCR 反應體系：10×Taq buffer緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L 的 d NTP 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、引物 ITS4(10 μmol/L)和 ITS4(10 μmol/L)各 0.5 μL，BSA 溶液 2 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 17.5 μL，總體積 25 μL。PCR 反應程序：94℃預變性 5 min；94℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸55 s，循環30次；72℃延伸10min；4℃保存。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像儀分析條帶。割膠回收條帶清晰的樣品，將純化后的樣品送北京諾賽基因測序公司測序。

1.2.2 數據處理與分析利用BioEdit 5.0.6對序列測序結果進行手工校正，將獲得的正確序列在NCBI數據庫中進行同源比對搜索，確定與本實驗克隆親緣關系最近的種屬名稱；挑選親緣關系相近的參考序列，采用MEGA 5.0軟件進行系統發育分析及系統發育樹構建。

2 結果與分析

2.1 地衣型真菌種類

對地衣型真菌樣品的陽性克隆進行測序，將所獲得的 rDNA-ITS片段在 NCBI數據庫中進行Blast比對，結果見表2，同時對具有較高同源性的參考序列共同構建系統發育樹（圖1）?？梢钥闯觯舜握{查共發現8科13屬26種地衣型真菌，其中擔子菌門1種，子囊菌門25種。

圖1 地衣序列進化樹

表2 真菌序列與GenBank數據庫中克隆序列比對結果

2.2 地衣內生真菌種類

對地衣內生真菌樣品進行DNA提取克隆，測序陽性克隆，將目的序列與GenBank數據庫中的序列進行比對分析，結果見表3。根據表3可將內生真菌分為擔子菌門和子囊菌門兩大類，對具有較高同源性的參考序列共同構建系統發育樹（圖2、3）。此次調查共發現31種內生真菌，其中擔子菌門包含8種，子囊菌門包含23種。

圖2 擔子菌門內生真菌進化樹

表3 真菌序列與GenBank數據庫中克隆序列比對的結果

續表3 真菌序列與GenBank數據庫中克隆序列比對的結果

續表3 真菌序列與GenBank數據庫中克隆序列比對的結果

3 討論與結論

3.1 地衣型真菌多樣性

地衣中的共生菌多為子囊菌，少數為擔子菌，主要負責吸收水分和無機鹽；提供光合作用的共生體多為藍藻或綠藻，負責制造營養物質[13-17]。本研究根據序列測序結果共得到地衣型真菌 26種，其中25種地衣型真菌為子囊菌門，隸屬8科13屬，分別為點衣屬（Ocellularia）、茶漬衣屬（lecanora）、文字衣屬（Graphis）、樹花屬(Ramalina)、大葉梅屬(Parmotrema)、凸唇衣屬(Platygramme)、Thelotremateae、絮緣衣屬（Byssoloma）、Absconditella、Austroparmelina、類小核衣屬（Pyrenula）、Chaenothecopsis、Graphidoideae。文字衣科(Graphidaceae)的地衣占50%，其中擔子菌門只有一種，為云片衣屬。說明在銅鼓嶺熱帶季雨矮林內，子囊菌門的地衣在地衣種類中占絕對優勢，且文字衣科的地衣最多。

3.2 地衣內生真菌多樣性

地衣內生真菌與植物內生真菌相似，不僅不引起宿主表現病癥，在分類學、多樣性和進化歷史等方面也都有一定的相似性[18]。李銘[19]研究中國云南麗江老君山地區的地衣內生真菌多樣性時，對68株具有代表性的真菌菌株進行分子生物學鑒定，結果發現，該地區的內生真菌全部屬于子囊菌門，分屬于座囊菌綱、散囊菌綱、垂舌菌綱、茶漬綱、糞殼菌，共5綱17目，多樣性程度較高，并指出不同地衣類型是地衣內生真菌多樣性的主導因素。

本研究根據結果將所調查的地衣內生真菌分為31種，可以劃分擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)兩個大類，其中擔子菌門包含8種，分屬于柄銹菌綱(Pucciniomycetes)、擔子菌綱(Heterobasidiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)，共 4綱 5目；子囊菌門包含 23種，分屬于子囊菌綱（Ascomycetes）、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、核菌綱(Pyrenomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、圓盤菌綱(Orbiliomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)，共6綱10目。表明在地衣體內除去構成地衣的地衣型真菌，地衣內生真菌也是種類和資源豐富的物種，此類真菌可能會對地衣自身的生長產生一定的影響，有待深入系統地開展研究。

圖3 子囊菌門內生真菌進化樹

目前，關于海南地衣的研究報道還相對較少，本研究嘗試對銅鼓嶺熱帶季雨矮林內的地衣進行調查，利用當前流行的分子測序技術，鑒定地衣及其內生真菌的種類。雖然本實驗樣地內的地衣型真菌和地衣內生菌群落顯示出了一定的生物多樣性，但與 GenBank數據庫進行同源性比對發現，多數地衣型真菌和地衣內生菌為未知群落，導致無法明確大部分地衣型和地衣內生菌的分類，然而這一結果也暗示，該區地衣型真菌和地衣內生菌可能具有其獨特的新類群。因此，對該區生態系統中的地衣開展研究具有重大價值和意義。