TPD52在HER-2陽性乳腺癌中的表達及其臨床病理意義

左志博 鄔萬新 李 鑫 張 琳 楊宏杰 汪靜宇 郭志琴 胡少青

乳腺癌中人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)過度表達或HER-2基因擴增，被稱為HER-2陽性乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%。它是一種高度侵襲性腫瘤，以HER-2介導的致癌途徑激活為特征，這些致癌途徑驅動細胞周期進展、血管生成、高侵襲和代謝重編程，由于腫瘤生長速度快，對細胞毒性化療缺乏反應，因此預后較差[1]。在過去20年中，針對HER-2的靶向藥物的引入顯著改善了患者的預后，但并非所有患者都能治愈，抗HER-2治療出現了耐藥性是大多數治療失敗的原因。越來越多的研究顯示，在多個系統的腫瘤中都發現了腫瘤蛋白D52(tumor proteins d52，TPD52)的表達過度，它影響著細胞的增殖、凋亡及腫瘤轉移。本研究主要探討TPD52在HER-2陽性乳腺癌中的表達狀況并分析其與臨床病理特征的相關性，探討TPD52與腫瘤發生、發展的關系，為HER-2陽性乳腺癌患者的治療提供新的靶點。

對象與方法

1.實驗對象：石蠟組織選擇2020年1～12月嘉興市第一醫院手術切除標本的120例患者，分為正常乳腺組織組30例、HER-2陰性乳腺癌組30例及HER-2陽性乳腺癌組60例，上述標本由兩名病理醫生在石蠟切片及免疫組化染色后獨立評估。所有納入對象術前未接受過放化療等新輔助治療，未合并其他惡性腫瘤，有完整的臨床病理資料。本研究通過筆者醫院醫學倫理學委員會審批。

2.主要設備及試劑：選用LECIA輪轉式石蠟切片機、Roche Benchmark XT全自動免疫組織化學儀及DAKO全自動染色封片機等。小鼠抗人單克隆抗體TPD52抗體購自英國Abcam公司，Cyclin D1抗體和EDTA抗原修復液等購自北京中杉金橋公司。

3.方法：所有組織標本進行連續切片，切片厚度為4μm。免疫組化使用Roche Benchmark XT全自動免疫組織化學儀進行染色，隨后進行顯微鏡鏡下閱片。以PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，使用已知TPD52及Cyclin D1表達陽性的前列腺組織為陽性對照。

4.結果判讀標準：根據腫瘤細胞陽性百分比和染色強度計算TPD52免疫組化染色評分[2]。染色強度評分標準：無染色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性百分比評分標準：<5%為0分；5%～25%(不含)為1分；25%～50%(不含)為2分；≥50%為3分。由同兩名病理醫生采用盲法單獨閱片評分。將上述兩個分值的乘積作為最終分值，定義TPD52表達水平如下：-(0～1分)、+(2～3分)、++(4～6分)及+++(>6分)。將-或+定義為無表達或低表達，++或+++定義為高表達。

5.統計學方法：應用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.不同乳腺組織中TPD52的表達水平：免疫組織化學法顯示TPD52蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細胞質(圖1)。TPD52在乳腺癌中的高表達率為44.4%(40/90)，高于正常乳腺組織(0)，差異有統計學意義(χ2=20.000，P<0.001)。TPD52在HER-2陽性乳腺癌中的高表達率為53.3%，高于HER-2陰性乳腺癌的26.7%，差異有統計學意義(χ2=5.760，P=0.024，表1)。

圖1 TPD52在乳腺組織中的表達(Envison, ×400)A.正常乳腺組織；B.HER-2陽性乳腺癌低表達;C.HER-2陽性乳腺癌高表達

表1 TPD52在不同乳腺組織中的表達率[n(%)]

2.TPD52與HER-2陽性乳腺癌臨床病理特征的關系：TPD52的表達與HER-2陽性乳腺癌患者的年齡、腫塊直徑、組織學分級無關，差異無統計學意義(P>0.05)，但與淋巴結轉移、TNM分期、ki-67表達及Cyclin D1表達有關，差異均有統計學意義(P均<0.05)。有淋巴結轉移者的TPD52高表達率高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義(P=0.001)；TNM分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的TPD52高表達率逐步上升，3組間比較差異有統計學意義(P<0.001)；高ki-67表達者的TPD52高表達率高于低ki-67表達者，差異有統計學意義(P=0.019)；高Cyclin D1表達者的TPD52高表達率高于低Cyclin D1表達者，差異有統計學意義(P=0.019，表2)。

表2 HER-2陽性乳腺癌中的TPD52表達與臨床病理特征[n(%)]

討 論

乳腺癌是全球第2大癌癥，發生率達到11.9%，它也是女性中發生率最高的癌癥，占所有女性新發癌癥的25.2%[3]。盡管醫學研究取得了重要進展，乳腺癌患者的病死率已經得到了顯著的改善，但是在伴有轉移的情況下，其中位生存率依然很低。根據乳腺癌的臨床病理和分子分型，目前將雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2 3種基因的表達作為乳腺癌個體化治療的關鍵。人表皮生長因子受體2是表皮生長因子受體家族中的一種跨膜酪氨酸激酶受體，在20%的乳腺癌中出現了基因擴增或過表達，并且在缺乏系統性治療的情況下與預后不良密切相關[4]。HER-2陽性乳腺癌有著更具侵襲性的組織病理學和臨床特征，例如高組織學分級以及轉移潛能增高，同時還激活各種細胞信號通路加速細胞增殖和凋亡抑制[5]。

近年來HER-2陽性乳腺癌也取得了很大進展，臨床試驗確立了單克隆抗體曲妥珠單抗作為HER-2陽性乳腺癌的治療標準，除此之外還有低分子拉帕替尼和來那替尼也提供了額外的治療選擇[6]。曲妥珠單抗雖然可以顯著改善乳腺癌患者的預后，也是HER-2靶向治療的關鍵。然而，HER-2的表達并不保證對曲妥珠單抗或其他HER-2靶向治療有臨床療效，在最初階段或許有療效，但很多最后出現了耐藥與復發[7]。這種耐藥的出現使得抗HER-2治療成為臨床治療HER-2過表達型乳腺癌的難題。因此，針對HER-2及其藥物治療抵抗進行研究，尋找一些HER-2治療相關線索，對改善HER-2陽性乳腺癌患者治療效果會有巨大的幫助。

TPD52是一種含有螺旋序列的承載蛋白，在細胞增殖、凋亡、囊泡運輸、腫瘤發生和轉移中發揮重要作用[8]。TPD52位于染色體8q21，編碼蛋白約為200個氨基酸，在多種腫瘤中存在著過度表達，并且與腫瘤的預后不良密切相關[2]。

本研究發現，TPD52在乳腺癌中的表達水平顯著高于正常乳腺組織，并且在HER-2陽性乳腺癌中的表達水平顯著高于HER-2陰性乳腺癌，提示TPD52可能參與了乳腺組織的癌變過程。Roslan等[9]研究表明，乳腺癌中TPD52存在表達上調，并且TPD52在HER-2陽性亞型中出現顯著過度表達，TPD52的高水平與乳腺癌患者的無病生存率差密切相關，同時發現HER-2擴增的乳腺癌細胞系依賴TPD52進行存活，這提示TPD52的過度表達可能促進HER-2靶向治療的抵抗。除此之外，與正常前列腺組織比較，TPD52在前列腺癌中的表達水平顯著增高，并且其表達水平與Gleason分級和疾病進展呈正相關，具有對疾病預后預測的潛在價值[10]。與正常卵巢上皮比較，在卵巢癌所有組織學亞型中均發現存在著TPD52過度表達[11]。

TPD52在肺鱗狀細胞癌中也存在表達增高，并且通過敲除TPD52基因能夠使腫瘤細胞的侵襲性得到了顯著抑制[12]。與正常睪丸比較，TPD52在原發性睪丸生殖細胞腫瘤中過度表達。正常睪丸中未檢測到TPD52的表達，只有少部分癌前病變樣本中檢測到TPD52的表達，提示TPD52參與了細胞的惡變進展[13]。TPD52在結直腸癌中也出現了過表達，在轉移性癌灶中檢測出的TPD52水平比原發灶要顯著增加，并且其高表達水平與高分期及差預后密切相關[14]。在膽管癌中也檢測到了TPD52的表達增高，其高表達水平與癌組織的病理學分化程度、腫瘤分期和預后較差呈正相關[15]。國外研究者通過蛋白質組學數據進行比較分析，發現TPD52在膽囊癌中出現了表達的上調[16]。除此之外，在膠質母細胞瘤也出現了TPD52的過度表達[17]。在急性髓系白血病患者中發現存在TPD52的表達升高，并且Kaplan-Meier曲線顯示TPD52過度表達與患者的預后不良密切相關[18]。同時本組結果也顯示了HER-2陽性乳腺癌中TPD52的表達與淋巴結轉移及高TNM分期差異有統計學意義，提示著TPD52可能增強了腫瘤的惡性程度。

此外，本研究結果顯示在HER-2陽性乳腺癌中TPD52高表達組的的乳腺癌組織ki-67及Cyclin D1表達水平也顯著增高。ki-67是一種腫瘤增殖蛋白，只在分裂期的細胞核中表達，Cyclin D1是一種細胞周期蛋白，推動細胞從G1期進入S期，本研究結果提示，TPD52可能通過調節細胞周期來促進腫瘤細胞的增殖。Ren等[19]研究了乳腺癌中TPD52的作用，結果顯示，與對照組比較，TPD52基因敲除后的腫瘤出現了ki-67表達水平的降低，并且上調TPD52的表達促進了乳腺癌細胞系的增殖，這些提示TPD52有著促進腫瘤增殖的作用。Dasari等[20]在前列腺癌中發現，TPD52的基因擴增能夠上調抗凋亡基因的表達并且下調促凋亡基因的表達，從而促進著細胞的增殖能力，并且TPD52的過表達通過增強細胞周期蛋白Cyclin D1來保護前列腺癌細胞系免受細胞凋亡。Wang等[21]研究發現，在膠質瘤細胞株中，TPD52的敲除不僅顯著抑制細胞增殖和集落形成，而且在體外誘導了G0/G1細胞周期停滯。有研究者通過下調TPD52的表達水平，發現能夠抑制子宮平滑肌瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡并且在G1期停滯[22]。國外研究顯示，通過下調乳腺癌中TPD52的表達能夠顯著抑制細胞增殖并且誘導凋亡，從而提升乳腺癌細胞對放射治療的敏感度[23]。Abe等[24]在口腔鱗狀細胞癌中發現了TPD52的過表達，并且可促進細胞增殖及細胞死亡抵抗。此外，在胰腺癌、宮頸癌和鼻咽癌中，沉默TPD52基因的表達也能夠降低癌細胞的增殖活性并且誘導其凋亡[25～27]。

綜上所述，本研究證實了TPD52在HER陽性乳腺癌組織中存在顯著表達上調，同時與腫瘤惡性程度升高及細胞增殖能力增強密切相關。因此，今后TPD52可能會為HER-2陽性乳腺癌患者的靶點治療提供基礎依據。