闌尾黏液性腫瘤中KRAS基因突變分析

李 方 侯 芳 齊長海 盧一艷 劉文婷 方 蘭 呂志勇 李珂敏

闌尾黏液性腫瘤(appendiceal mucinous neoplasms, AMNs)是一類罕見的異質性闌尾腫瘤的總稱，其發病機制尚不清楚。AMNs膨脹性或侵襲性浸潤闌尾壁，導致黏液性腫瘤上皮及黏液播散至腹腔形成腹膜假黏液瘤(pseudomyxoma peritonei, PMP)。近年來分子病理學研究證實多種消化系統惡性腫瘤存在KRAS基因突變，使其治療進入了分子靶向治療的新時期。國外研究發現，AMNs存在KRAS基因的突變，但中國人AMNs是否存在KRAS基因突變還不清楚。本研究對AMNs組織采用實時熒光定量PCR法檢測KRAS基因的突變，揭示AMNs中KRAS基因突變類型及突變率，探討KRAS基因突變與臨床病理特征的相關性，為其靶向治療提供潛在靶點提供理論依據。

對象與方法

1．研究對象：回顧性收集2019年6月～2021年9月在航天中心醫院進行手術切除并經病理證實的AMNs標本62例，其中低級別闌尾黏液性腫瘤(low-grade appendiceal mucinous neoplasms, LAMN)36例，闌尾黏液腺癌(mucinous adenocarcinoma, MAC)26例。62例AMNs患者中有男性22例，女性40 例，男女性別比例為1∶1.82?；颊吣挲g29～79歲，中位年齡為59歲，年齡≤60歲的患者33例，年齡>60歲的患者29例。對入選的病例進行臨床病理資料的收集。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會審批。

2．診斷標準：按照2019年第5版世界衛生組織(WHO)闌尾黏液性腫瘤的診斷標準及2017年美國癌癥聯合會(AJCC)腫瘤分期，由消化道腫瘤經驗豐富的病理醫生對以下組織病理學參數進行評估[1，2]：闌尾原發性黏液性腫瘤的類型、繼發性PMP級別、脈管及神經侵犯、腫瘤分級、病理分期。將AMNs分為LAMN G1和MAC G2，將AMNs繼發性PMP分為低級別PMP G1、高級別PMP G2和高級別PMP G3(高級別PMP伴有印戒細胞成分)，如果原發性AMNs與繼發性PMP級別不同的情況下，將綜合最高的級別確定為該病例的AJCC腫瘤分級：G1(LAMN或低級別PMP)、G2(MAC或高級別PMP G2)和G3(闌尾印戒細胞癌或高級別PMP G3)。

3．方法：選取每例中代表性區域的蠟塊，確保腫瘤細胞含量在30%以上，用無菌刀片切取5張10μm厚的連續石蠟切片，置于無菌的1.5ml離心管中。根據核酸提取試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)說明書步驟提取DNA，并用紫外分光光度計測量DNA濃度。按照人類KRAS基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司)所示，采用探針擴增阻滯突變系統(amplification refractory mutation system，ARMS)在熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)進行擴增。每批次檢測均設置陽性和陰性對照。反應循環參數：95℃ 5min；95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15個循環；93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，31個循環。在第3階段60℃時收集信號，保存文件。根據各反應擴增曲線判讀結果：以無模板對照擴增曲線的最高點為準設定閾值。結果判定：突變陰性：所有反應管均沒出現擴增曲線或Ct 值≥陰性臨界Ct值；突變陽性：①出現擴增曲線且 Ct≤26；②26

4．統計學方法：應用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行統計分析。組間比較分析采用χ2檢驗、連續性校正χ2檢驗或Fisher精確檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1．臨床病理特征： 62例AMNs中LAMN G136例，MAC G226例。12例不伴有PMP，50例伴有PMP，其中29例伴有低級別PMP G1(其中3例伴有無細胞性黏液)，21例伴有高級別PMP(高級別PMP G2為15例，高級別PMP G3為6例)。AJCC腫瘤綜合分級中， G1為35例，G2為21例，G3為6例。無淋巴結轉移的26例，有淋巴結轉移的7例。無神經侵犯的58例，有神經侵犯的4例。無脈管侵犯的60例，有脈管侵犯的2例。AJCC病理分期中，0期5例，Ⅱ期6例(Ⅱa期4例，Ⅱc期2例)，Ⅲb期1例，Ⅳa期30例，Ⅳb期20例。AMNs及繼發性PMP病理形態學改變詳見圖1。

圖1 闌尾黏液性腫瘤及繼發性腹膜假黏液瘤的組織病理學改變A.低級別闌尾黏液性腫瘤G1；B.繼發性低級別腹膜假黏液瘤G1；C.闌尾黏液腺癌G2；D.繼發性高級別腹膜假黏液瘤伴印戒細胞成分G3 (A～C.HE，×100;D.HE，×200)

2.KRAS基因突變類型與突變率：在62例AMNs標本中，共檢出KRAS基因突變52例，突變率為83.9%。對KRAS 第2、3、4號外顯子均進行檢測，本組AMNs病例均為 KRAS的第2號外顯子突變，突變類型為12位密碼子G12D、G12A、G12V、G12S、G12C，以及13位密碼子G13D，其中G12D(35G>A)及G12V(35G>T)突變最為常見，分別占44.2%(23/52)及36.5%(19/52)。2例伴有12位密碼子2個位點的突變，包括G12D和G12S、G12V和G12C。KRAS第3、4外顯子均未檢測到突變。AMNs中KRAS基因突變類型詳見表1和圖2。

表1 闌尾黏液性腫瘤中KRAS基因突變類型與突變率

圖2 KRAS 基因突變類型及擴增曲線A.KRAS基因2號外顯子G12D突變；B.KRAS基因2號外顯子G12V突變

3.KRAS基因突變與臨床病理特征的關系：62例AMNs中，LAMN中 KRAS 基因突變率為88.9%(32/36)，略高于MAC中KRAS 基因突變率 76.9%(20/26)，但差異無統計學意義(P>0.05)。低級別PMP G1及高級別PMP G2中KRAS基因突變率分別為89.7%(26/29)和80.0%(12/15)，高于高級別PMP G3中KRAS基因突變率66.7%(4/6)，但差異無統計學意義(P>0.05)。同樣，AJCC腫瘤級別G1的KRAS基因突變率為88.6%(31/35)，略高于G2(81.0%)及G3(66.7%)，但差異無統計學意義(P>0.05)。此外，KRAS基因突變與性別、年齡、有無淋巴結轉移、有無脈管侵犯、有無神經侵犯及 AJCC病理分期均無明顯相關性(P均>0.05)。KRAS基因突變與臨床病理特征的相關性詳見表2。

表2 闌尾黏液性腫瘤中KRAS基因突變與臨床病理特征的相關性[n(%)]

討 論

AMNs及繼發性PMP的發病機制尚不明確。KRAS基因位于12p12.1，是RAS基因家族的一個原癌基因，該家族還包含HRAS、NRAS等，其中KRAS基因與人類腫瘤的發生、發展關系最為密切。KRAS基因編碼的K-ras蛋白是EGFR下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK, 即RAS/RAF/MEK/ERK)信號通路中一個起“開關”作用的關鍵分子。MAPK信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡、轉移和代謝等過程中發揮著重要作用。當KRAS基因發生突變時，導致其不依賴上游的EGFR發生自身磷酸化而持續處于激活狀態。多種腫瘤存在KRAS基因突變，其中胰腺癌、結直腸癌、肺癌最為常見，結直腸癌KRAS突變率為39.6%～41.3%[4～ 7]。

對于AMNs及PMP中KRAS基因的狀態，僅有少數國外研究報道了小樣本量病例的分子遺傳學改變。Zauber等[8]對31例LAMN的KRAS基因測序結果提示100%的病例出現突變，其中 G12D 和 G12V最為常見(各占42%)；并對照了正常闌尾42例，其KRAS基因均為野生型。Alakus 等[9]對10例闌尾源性PMP的全外顯子測序及19例PMP熱點基因測序結果提示KRAS突變率為89.6%。Noguchi 等[10]對18例PMP進行二代測序結果表明KARS突變率為77.8%。Zhu等[11]按照2017年AJCC闌尾腫瘤分級研究了21例LAMN G1、21例MAC G2及26例印戒細胞癌G3，結果發現其KRAS基因突變率分別為90%、86%、46%。本研究是對中國人AMNs中KRAS基因突變狀態的研究，與既往研究報道相似，中國人KRAS基因同樣存在高頻突變，突變率為83.9%，最常見的位點為12號密碼子G12D及G12V，分別占44.2%及36.5%。KRAS基因突變與AMNs類型、繼發性PMP級別、AJCC病理分級及分期、有無淋巴結轉移、有無脈管及神經侵犯等代表腫瘤惡性度的臨床病理參數均無顯著相關，提示KRAS基因的高頻突變可能是AMNs的早期分子事件，與AMNs的進展及侵襲無關。

關于KRAS基因突變在AMNs疾病發生、發展中的作用機制，目前研究極少。AMNs及PMP顯著特征是具有大量黏液性腹腔積液，黏蛋白是其重要成分，包括MUC2、MUC5B、MUC5AC[12]。MUC2、MUC5AC基因與MUC5B和MUC6共同形成MUC基因串，定位于11p15.5。多項體外實驗提示MAPK信號通路可能是調控MUC2和MUC5AC過表達的重要機制。Bae等[13]研究證實，在人呼吸道上皮細胞中細菌產物通過MAPK通路誘導MUC5AC過表達。Dilly等[14]研究證實，在分泌MUC2的細胞系LS174T及小鼠腹腔內PMP異種移植模型中，使用MEK抑制劑可以減少MUC2的產生和黏液性腫瘤的生長。

KRAS基因突變在結直腸癌、肺癌患者的研究，已促使個體化治療進入了分子靶向治療的新時期。國內外結直腸癌診治指南中明確提出分子靶向藥物的治療前提需檢測KRAS基因突變的狀態，KRAS基因突變將導致患者不能從抗EGFR靶向藥物的治療中獲益。AMNs及繼發性PMP目前的治療手段匱乏，僅局限于細胞減滅手術及腹腔熱灌注化療。本研究證實中國人的AMNs同樣存在高頻突變，臨床可探索研究使用MEK抑制劑阻斷該信號通路，進而抑制黏液的產生，達成治療PMP的目的。

綜上所述，AMNs及繼發性PMP是一類罕見的消化系統腫瘤，其發病機制尚不明確。本研究證實中國人AMNs中存在KRAS基因的高頻突變，提示KRAS基因突變可能參與了AMNs的發病，臨床可探索針對KRAS基因突變的靶向治療。