長山群島海域真核微藻粒級結構及扇貝攝食選擇性

宋 倫,宋廣軍,吳金浩,楊國軍,劉 印,劉蘇萱

1 遼寧省海洋水產科學研究院,海洋生物資源與生態學重點實驗室,大連 116023 2 大連海洋大學,大連 116023

大連長山群島是海水貝類的主要增養殖區,近40年來為地方經濟發展做出了巨大貢獻。但近10年,增養殖雙殼貝類死亡率普遍升高,嚴重制約了貝類增養殖業的可持續健康發展。餌料微藻作為濾食性貝類的營養基礎,不同粒級營養含量差異較大,被濾食性貝類利用率也不同[1—2]。

小粒級微藻會影響貝類營養儲備和健康生長,尤其對質量選擇型的貝類影響更大[3]。因此研究小粒級微藻群落結構演變尤為重要,但目前微藻的分類鑒定依然依靠傳統的形態學鏡檢,對小粒級微藻的檢出率較低。高通量測序鑒定技術可加速小粒徑微藻多樣性的高效檢測[4—7]。目前,分析海水中微藻粒級的方法用的最多的是葉綠素a分級法,將被測海水依次通過不同孔徑的濾膜過濾,檢測其葉綠素a含量表征微藻粒級生物量,但該方法會嚴重低估中、小粒級微藻的生物量,而高估>20 μm大粒徑微藻生物量的貢獻,研究發現,該方法對小粒徑微藻生物量的測算誤差最高超過80%[8—10]。分子鑒定法相比傳統形態學鑒定更加精準、高效、符合實際,應用前景廣闊。研究發現,環境樣本中真核生物rDNA序列多態性與細胞中rDNA的拷貝數成正比[11—12],即真核微藻細胞體積(生物量)與rDNA的拷貝數成正比[13—15],因此,不同真核微藻分子鑒定獲取的rDNA序列數之比即為生物量占比,可用于微藻全粒級結構深度分析。宋等[16]采用該方法解析了長海縣大長山島鄰近海域微藻粒級組成與環境因子的關聯。

本研究在采集微藻樣品的基礎上,對長山群島海域微藻粒級結構在時空上的演變,其與蝦夷扇貝攝食選擇性等進行分析,探討環境因子對各粒級微藻結構的影響關聯,采用高通量測序-分子鑒定分級技術對該海域微藻粒級結構進行估算,研究海洋微藻粒級時空分布與環境關聯及對扇貝攝食選擇的影響,為精準研究濾食性貝類供餌力提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及制備

圖1 采樣站位示意Fig.1 Sampling sites

1.2 微藻基因組DNA提取

采用CTAB法提取真核微藻宏基因組,具體參考相關文獻[16]。

1.3 18S rDNA V4可變區的PCR擴增

利用自行開發的真核微藻18S rDNA的V4區基因擴增引物進行PCR擴增,具體步驟參考相關文獻[19]。

1.4 測序數據質量控制

測序所得原始數據處理、有效數據質量過濾、物種聚類、微藻注釋等質量控制方法參考相關文獻[20]。

1.5 數據分析

物種聚類、注釋分類采用的方法和數據庫參考相關文獻[21]。根據相關研究,不同粒徑的真核微藻序列數比例更接近于生物量比例[13—16],將各個樣本微藻優勢度超過0.1%的種類作為整體優勢種參與粒級結構統計,根據相關文獻將篩查出的優勢種按等效球徑進行篩檢分級[13—15,22—25],根據各粒徑微藻序列占比統計其粒級結構,同時利用序列數占比和總葉綠素a濃度可測算各粒級微藻的葉綠素a濃度,相關公式：

式中,DBi為某粒級微藻的葉綠素a濃度(μg/L)；NBi為總葉綠素a濃度(μg/L)；DC為某粒級微藻的序列數；NC為所有微藻的序列數。

物種生物量優勢度(Y)表示微藻群落中某一物種質量所占的優勢程度：

式中,nx為第x種微藻種類的OTUs (Operational Taxonomic Units)數,N為OTUs總數,fx為第x種微藻種類在各樣品中出現的頻率。

采用Ivlev選擇指數E來分析貝類對微藻的攝食選擇性[26]：

式中,ri表示微藻i在貝類胃含物中所占的百分比,pi表示微藻i在水體中的生物量百分比。E范圍為[-1,1],當E為-1時,表示貝類避食微藻i；當E為1時,表示貝類主動選擇微藻i；當E接近0時,表示貝類隨機攝食浮游植物i。

本文的小、中、大粒徑微藻表述分別代指微微型藻類(0.22—3 μm)、微型藻類(3—20 μm)及小型藻類(>20 μm)。

對上述公式計算、數據分析、RDA排序圖均通過WPS Office、SPSS 19.0、PRIMER 5.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 測序數據質量和物種注釋

測序所得有效數據春季每個樣品平均獲得89616條原始序列,夏季獲得91419條原始序列,秋季獲得83722條原始序列,經過拼接和質量過濾,春夏秋季每個樣品平均得到78709、81392、76988條有效序列,高質量序列數均達到87%以上,測序正確率達到98%以上,測序數據準確可靠,可進行OTUs聚類和物種分類分析。數據處理過程中各步驟得到的統計結果見表1。

表1 有效序列數及OTUs數統計

2.2 真核微藻各粒級優勢種演替規律

長山群島各粒級微藻優勢種及優勢度分析見表2和圖2。其中,春季融合微胞藻(Micromonascommoda)、曼吉尼刺囊甲藻(Blastodiniummangini)、細小微胞藻(Micromonaspusilla)在小粒級微藻群落中生物量優勢度較高,分別為0.166、0.119、0.114；夏季細小微胞藻、金牛微球藻(Ostreococcustauri)、曼吉尼刺囊甲藻生物量優勢度較高,分別為0.342、0.257、0.057；秋季金牛微球藻、曼吉尼刺囊甲藻、細小微胞藻生物量優勢度較高,分別為0.263、0.231、0.163。綜合來看,細小微胞藻和金牛微球藻在小粒級微藻群落中占有絕對優勢,春夏秋季演替規律由細小微胞藻占優勢轉為金牛微球藻控制生態位。由于小粒級微藻粒徑較小,細胞中rDNA的拷貝數較少,推測其數量優勢度在整個微藻群落中占有絕對優勢。

表2 3不同粒級微藻優勢種

圖2 各粒級微藻第一優勢種及優勢度Fig.2 The first dominant species and dominant degree of microalgae in each grain size 物種下方數字為該物種在本粒級中優勢度

春季劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum)和三葉原甲藻(Prorocentrumtriestinum)在中粒級微藻群落中生物量占有絕對優勢,優勢度分別為0.457、0.151；夏季劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum),蟲黃甲藻(Ansanellagranifera),三葉原甲藻生物量優勢度較高,分別為0.362、0.128、0.121；秋季劇毒卡爾藻和三葉原甲藻生物量優勢度較高,分別為0.678、0.084。綜合來看，各季節劇毒卡爾藻在中粒級微藻群落中一直占有絕對優勢。

春季柔弱幾內亞藻(Guinardiadelicatula),北極多甲藻(Islandiniumminutum),微型裸甲藻(Gymnodiniummicroreticulatum),矮小短棘藻(Detonulapumila),中肋海鏈藻(Thalassiosiramala)在大粒級微藻群落中生物量優勢度較高,分別為0.245、0.193、0.151、0.142、0.131；夏季平野亞歷山大藻(Alexandriumhiranoi)和紅色赤潮藻(Akashiwosanguinea)生物量優勢度較高,分別為0.591、0.092；秋季多紋膝溝藻(Gonyaulaxpolygramma)生物量占有絕對優勢,優勢度為0.905。大粒級微藻優勢種在各季節演替較大,分別由不同種類占據主要生態位。

綜合整個真核微藻種群優勢分析,春季由中粒徑的劇毒卡爾藻占有絕對優勢,占比23.9%,其他微藻占比均小于8%；夏季由大粒徑的平野亞歷山大藻占有絕對優勢,占比29.4%,其他微藻占比均小于10%；秋季由大粒徑的多紋膝溝藻占有絕對優勢,占比高達66.8%,其他微藻占比均小于11%。由此可見,雖然整個微藻群落由大粒級微藻控制生態位,但都是有毒的甲藻,對長山群島海域增養殖的貝類貝毒累積風險較高。

2.3 微藻粒級結構特征

圖3給出了春夏秋季不同粒級葉綠素a含量,春季長山群島海域微藻生物量由中小粒級控制,夏季中小粒級生物量減低至與大粒級水平,秋季大粒級生物量猛增,主要是由有毒的多紋膝溝藻貢獻所致。

真核微藻粒級結構分析結果顯示,春季小粒級微藻組成平均(42±4)%,中粒級微藻組成平均(47±4)%,大粒級微藻組成平均(11±1)%(圖4)；夏季小粒級微藻組成平均(39±13)%,中粒級微藻組成平均(23±11)%,大粒級微藻組成平均(38±21)%,各站位分布差異比較大(圖5)；秋季小粒級微藻組成平均(22±8)%,中粒級微藻組成平均(18±6)%,大粒級微藻組成平均(60±8)%,各站位分布差異比較大(圖6)。

圖3 春、夏、秋季真核微藻各粒級含量Fig.3 Size fractions of eukaryotic microalgae in spring,summer and autumn

圖4 春季真核微藻粒級結構Fig.4 Size fractions of eukaryotic microalgae in spring

圖5 夏季真核微藻粒級結構Fig.5 Size fractions of eukaryotic microalgae in summer

圖6 秋季真核微藻粒級結構Fig.6 Size fractions of eukaryotic microalgae in autumn

整體而言,長山群島海域春季真核微藻以中、小粒級為主,整體生物量較高,小、中、大粒級微藻生物量比例為42∶47∶11；夏季以小、大粒級為主,各站位粒級結構波動較大,整體生物量較低,小粒級微藻主要分布在近岸海域,大粒級微藻主要分布在離岸海域,小、中、大粒級微藻比例為39∶23∶38；秋季以大粒級為主,生物量上升較大,各站位粒級結構相對比較均衡,小、中、大粒級微藻比例為22∶18∶60。

2.4 扇貝對微藻粒級的攝食選擇性

采用Ivlev選擇指數E對小長山島海域5—7月蝦夷扇貝胃含物與水體中微藻粒級進行了分析。發現筏養蝦夷扇貝對小粒級和大粒級微藻的選擇性較低,對中粒級微藻的選擇性較高(圖7—9),尤其對水體中優勢種劇毒卡爾藻一直表現出主動選擇,5、6、7月選擇性指數均為正值,分別為0.23、0.39、0.88(表3)。圖10也顯示了蝦夷扇貝主要攝食甲藻,主要種類也為劇毒卡爾藻。蝦夷扇貝對水體中優勢種小粒級的金牛微球藻、細小微胞藻、抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens),中粒級的阿米巴藻屬(Amoebophryasp.)、球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)、雷克斯棕囊藻(Phaeocystisrex),大粒級的旋轉海鏈藻(Thalassiosiracurviseriata)、絲狀短棘藻(Detonulaconfervacea)、多米尼環溝藻(Gyrodiniumdominans)、平野亞歷山大藻顯示出明顯回避性,選擇性指數均為負值。

圖7 蝦夷扇貝胃含物與水體中微藻粒級生物量占比Fig.7 The proportion of stomach contents and microalgae particle biomass in water of Mizuhopecten yessoensis

圖8 蝦夷扇貝胃含物與水體中小粒級微藻生物量占比Fig.8 Biomass ratio of stomach contents and small and medium sized microalgae in water of Mizuhopecten yessoensis

圖9 蝦夷扇貝對不同粒級微藻的選擇指數Fig.9 Selectivity index of Mizuhopecten yessoensis prawns to microalgae of different grain sizes

圖10 蝦夷扇貝對不同類群微藻的選擇指數Fig.10 Selectivity index of different groups of microalgae in Mizuhopecten yessoensis

2.5 真核微藻粒級結構與環境因素關聯

春、夏、秋季長山群島真核微藻粒級結構與環境因子的RDA分析見圖11,RDA分析中微藻種類縮寫編碼見表4,環境因子的解釋量及顯著性檢驗見表4。其中,春季顯著控制小粒級微藻群落結構的環境因素有重金屬Cd(P<0.01)、水深和COD(P<0.05),顯著控制中粒級微藻群落結構的環境因素只有DO(P<0.05),顯著控制大粒級微藻群落結構的環境因素只有COD(P<0.05)。

夏季顯著控制小粒級微藻群落結構的環境因素有重金屬Cd和DIN(P<0.05),顯著控制中粒級微藻群落結構的環境因素有DIN、pH、Oil(P<0.05),顯著控制大粒級微藻群落結構的環境因素有重金屬As和鹽度Sal(P<0.05)。

秋季顯著控制小粒級微藻群落結構的環境因素有COD和Sal(P<0.01),顯著控制中粒級微藻群落結構的環境因素只有Oil(P<0.05),顯著控制大粒級微藻群落結構的環境因素有重金屬Hg(P<0.01)和DO(P<0.05)。總體來看,COD、DIN、DO、Oil及部分重金屬Cd、As、Hg影響著整個真核微藻粒級結構時空演變。

表3 蝦夷扇貝對微藻的選擇指數

表4 環境因子的解釋量及顯著性檢驗

圖11 春季小粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.11 Community structure of microalgae and RDA ranking of environmental factors in spring RDA：冗余分析;COD：化學需氧量;DIP：無機磷;DIN：無機氮;DO：溶解氧;Dep：水深;Oil：石油類;Cd：鎘;Kar mic 微小卡羅藻 Karlodinium micrum;Coc pol：阿米巴藻屬有害甲藻 Cochlodinium polykrikoides;Hal sp：海球藻屬 Halosphaera sp.;Bat pra：綠色葡萄藻 Bathycoccus prasinos;Euk clone：真核微藻;Euk clo2：真核微藻;Mic Com：融合微胞藻 Micromonas commoda;Mic pus：細小微胞藻 Micromonas pusilla;Pte cri：具翅冠突藻 Pterosperma cristatum;Cer fal：共甲藻 Ceratoperidinium falcatum;Ost tau：金牛微球藻 Ostreococcus tauri;Pyc pro：密球藻 Pycnococcus provasolii;Bla man：曼吉尼刺囊甲藻 Blastodinium mangini;Aur ano：抑食金球藻 Aureococcus anophagefferens;Pra sp：青綠藻屬 Prasinophyceae sp.;Pro mic：海洋原甲藻 Prorocentrum micans;Pro min：微小原甲藻 Prorocentrum minimum;Eud cre：波緣杜波斯克藻 Euduboscquella crenulata;Ima rot：棕囊藻屬 Imantonia rotunda;Mam gil：青綠藻 Mamiella gilva;Bla con：扭曲刺囊甲藻 Blastodinium contortum;Amo sp：阿米巴藻屬 Amoebophrya sp.;Mar sp：共球藻屬 Marsupiomonas sp.;Fav arc：杜波斯克屬 Favella arcuata

圖12 春季中粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.12 Community structure of medium size microalgae and RDA ranking of environmental factors in spring Sal：鹽度；SS：懸浮物；Pro tri：三葉原甲藻 Prorocentrum triestinum；Cha sp：角毛藻屬 Chaetoceros sp.；Tha con：凹海鏈藻 Thalassiosira concaviuscula；Tha nor：諾登海鏈藻 Thalassiosira nordenskioeldii；Gui str：斯氏幾內亞藻 Guinardia striata；Ske sub：敏鹽骨條藻 Skeletonema subsalsum；Ast gla：冰河擬星桿藻 Asterionellopsis glacialis； Ske men：曼氏骨條藻 Skeletonema menzellii；Cha mue：牟氏角毛藻 Chaetoceros muellerii；Tha nod：結線形海鏈藻 Thalassiosira nodulolineata；Pyr sp：青綠皮藻屬 Pyramimonas sp.；Chr lea：里氏金色藻 Chrysochromulina leadbeateri；Ans gra：蟲黃甲藻 Ansanella granifera；Kar ven：劇毒卡爾藻 Karlodinium veneficum；Nep pyr：雙鞭綠藻 Nephroselmis pyriformis；Spu sp：色金藻屬 Spumella sp.；Tha pro：深海鏈藻 Thalassiosira profunda；Chl kuw：庫瓦達衣藻 Chlamydomonas kuwadae；Ske tro：熱帶骨條藻 Skeletonema tropicum；Hem cry：球半隱藻 Hemiselmis cryptochromatica

圖13 春季大粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.13 Community structure of macroalgae and RDA ranking of environmental factors in spring Gym mic：微型裸甲藻 Gymnodinium microreticulatum；Lev fis：菲斯環溝藻 Levanderina fissa；Per qui：五刺多甲藻 Peridinium quinquecorne endosymbiont；Oxy oxy：高氧鰭藻 Oxyphysis oxytoxoides；Tha mal：中肋海鏈藻 Thalassiosira mala；Ale aff ：相關亞歷山大藻 Alexandrium affine；Pse mul ：多列擬菱形藻 Pseudo-nitzschia multiseries；Gra ton：通洋多甲藻Grammatodinium tongyeonginum；Cer pel：大洋角管藻 Cerataulina pelagica；Gui del：柔弱幾內亞藻 Guinardia delicatula；Tha rot：圓海鏈藻 Thalassiosira rotula；Gon spi：具刺膝溝藻 Gonyaulax spinifera；Det pum ：矮小短棘藻 Detonula pumila；Par imp：無孔近囊胞藻 Paraphysomonas imperforata

3 討論

3.1 真核微藻優勢種及粒級結構演變

本研究發現,長山群島海域第一優勢種均為有毒甲藻,春季為劇毒卡爾藻占比23.9%,夏季為平野亞歷山大藻占比29.4%,秋季為多紋膝溝藻占比66.8%,均高于黃海北部優勢種平均值(3種優勢種分別占比21.3%、23.6%、56.6%)[7],說明該海域為有毒甲藻主要分布區,應引起注意。從粒級結構看,長山群島海域小粒級真核微藻占比(春季42%、夏季39%、秋季22%)與黃海北部整體水平(39%、夏季40%、秋季26%)相差不大,春夏季略微偏高,不利于濾食性的貝類營養儲備[7]。本次調查的小粒級真核微藻優勢種主要為細小微胞藻和金牛微球藻,而2018年大長山島臨近海域調查的優勢種為抑食金球藻[16],雖然優勢種年度間發生演替,但金牛微球藻和抑食金球藻作為褐潮致災種,應引起關注[10,19,27],當然,微藻粒級結構的測算方法需不斷完善和優化,使研究結果更趨于客觀實際[3,9,16]。

3.2 不同微藻粒級對扇貝攝食的影響

本研究發現筏養蝦夷扇貝對小粒級和大粒級微藻的選擇性都較低,對中粒級微藻的選擇性確較高,尤其對水體中優勢種甲藻劇毒卡爾藻一直表現出主動選擇。有研究表明,濾食性貝類對甲藻的攝食選擇性要高于其他類群[26]。本研究發現,同樣作為水體中的優勢種,小粒級的金牛微球藻、細小微胞藻、抑食金球藻,蝦夷扇貝卻選擇避食,表明扇貝攝食選擇的復雜性。Cranford等[28]發現濾食性貝類偏好攝食微型藻類,Strohmeier等[29]發現紫貽貝(Mytilusedulis)對藻類的截留率從小粒徑到大粒徑逐漸增大,最大的截留率在7—35 μm。Rosa等[30]研究發現貽貝對4 μm及以上的藻類有較高的截留率,Dunphy[31]也發現牡蠣6 μm微藻的截留效率低于15 μm粒徑的微藻。張繼紅[32]發現紫貽貝對于2 μm的微藻截留率為19%、長牡蠣為17%、櫛孔扇貝僅為8%,對2 μm以下的顆粒物截留效率更低。上述研究結論與本研究發現的現象一致。該海域作為蝦夷扇貝主產區,不但微藻粒級結構影響其攝食營養與存活[33],有毒藻類更影響其質量安全,因此應推進微藻分子鑒定法應用,并加強貝毒潛在風險監測[34]。

3.3 環境因子對微藻粒級結構的影響

水體中環境因子對微藻生長、繁殖影響較大,進而控制其種群及群落在時空上的演變。本研究發現,不同季節控制各粒級微藻群落結構空間分布的環境因素不盡相同,總體而言,COD(春秋季)對小粒級微藻群落結構影響較大,說明某些小粒級微藻可對有機物進行高效利用[10],一般真核微藻都偏好無機營養鹽,如無機氮、磷、硅都是微藻生長的必須元素[35—37]。同時發現春夏季重金屬Cd都顯著控制小粒級微藻群落結構在空間上的分布,且對小粒級真核微藻優勢種細小微胞藻和金牛微球藻均是正向影響,應加強河流陸源入海重金屬的消減防控。當然,微藻粒級結構演變除受環境因子的上行效應影響之外,貝類及浮游動物大量攝食的下行效應也會影響微藻的粒級結構[38—39]。該海域幾十年來主要增養殖扇貝、牡蠣等濾食性貝類,對天然餌料微藻需求量較大。隨著陸源氮磷的消減,海域無機營養鹽逐漸減少,可能會加劇微藻小型化趨勢,希望能得到有關方面的關注。

4 結論

(1)長山群島海域真核微藻春季以中(47%)、小粒級(41%)為主,主要優勢種為劇毒卡爾藻(23.9%)；夏季以小(39%)、大粒級(38%)為主,主要優勢種為平野亞歷山大藻(29.4%)；秋季以大粒級(60%)為主,主要優勢種為多紋膝溝藻(66.8%)。

圖15 夏季中粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.15 Community structure of medium size microalgae and RDA ranking of environmental factors in summer

圖16 夏季大粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.16 Community structure of macroalgae and RDA ranking of environmental factors in summer Ale lee：李氏亞歷山大藻 Alexandrium leei；War sp：單眼藻屬 Warnowia sp.；Pol sch：斯氏多溝藻 Polykrikos schwartzii；Aka san：紅色赤潮藻 Akashiwo sanguinea；Ale hir：平野亞歷山大藻 Alexandrium hiranoi；Pol kof ：科夫多溝藻 Polykrikos kofoidii；Isl min：北極多甲藻 Islandinium minutum；Tha hen：亨氏海鏈藻 Thalassiosira hendeyi；Cos sp：圓篩藻屬 Coscinodiscus sp；Gon pol：多紋膝溝藻 Gonyaulax Polygramma；Pyr ste：斯氏扁甲藻 Pyrophacus steinii

圖17 秋季小粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.17 Community structure of microalgae and RDA ranking of environmental factors in autumn

圖18 秋季中粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.18 Community structure of medium grain microalgae and RDA ranking of environmental factors in autumn

圖19 秋季大粒級微藻群落結構與環境因子RDA排序Fig.19 Community structure of macroalgae and RDA ranking of environmental factors in autumn Lau bor：北方勞德藻Lauderia borealis

(2)小粒徑微藻中金牛微球藻和抑食金球藻曾在渤海引發褐潮,潛在威脅貝類養殖業。另外有毒甲藻在該海域中占有絕對優勢,中粒徑的劇毒卡爾藻在春季優勢明顯,優勢度在0.2以上,貝毒累積風險較高。

(3)蝦夷扇貝對小粒級和大粒級微藻的選擇性較低,對中粒級微藻的選擇性較高,尤其對水體中優勢種劇毒卡爾藻一直表現出主動選擇。

(4)COD、DIN、DO、Oil及部分重金屬Cd、As、Hg影響著整個長山群島海域真核微藻粒級結構時空演變。