真菌基因組組裝技術(shù)在《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》開放實(shí)驗(yàn)中的設(shè)計(jì)與實(shí)踐

李誠，楊再福，王勇

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)教研室，貴州貴陽 550025）

《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》課程是貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院院級(jí)平臺(tái)課和實(shí)驗(yàn)必修課，該門課程共48個(gè)學(xué)時(shí)，其中理論課32學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)課16學(xué)時(shí)。學(xué)生在掌握農(nóng)業(yè)微生物學(xué)理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)學(xué)習(xí)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)的基本技術(shù)和經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法[1]。開放實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與實(shí)踐是《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》的重要組成部分，教學(xué)內(nèi)容的安排強(qiáng)調(diào)與農(nóng)業(yè)微生物學(xué)的研究前沿密切相關(guān)，旨在引領(lǐng)學(xué)生掌握最新的前沿技術(shù)及研究熱點(diǎn)動(dòng)態(tài)，為強(qiáng)化學(xué)生的多元化培養(yǎng)和提升基本技能訓(xùn)練打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[2-3]。

真菌是微生物中的一大類群，在大自然中無處不在。真菌從酵母到蘑菇，生物多樣性復(fù)雜，可分解動(dòng)植物殘?bào)w，也可引起動(dòng)植物病害，還可合成抗生素藥物等。真菌基因組研究是由不同研究者根據(jù)各自所需而推動(dòng)起來的。從1996年第一個(gè)釀酒酵母真菌基因組公布以來[4]，到目前為止已有1 000多個(gè)真菌基因被相繼公布[5]。對(duì)真菌基因組學(xué)的研究可為真菌在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物能源和生態(tài)環(huán)境等領(lǐng)域的研究提供理論指導(dǎo)[6-7]。因此在《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》中設(shè)計(jì)真菌基因組的組裝開放實(shí)驗(yàn)尤為重要。

為了提高學(xué)生對(duì)真菌基因組組裝技術(shù)的認(rèn)知，我們以天麻褐腐病菌Fusarium oxysporum的三代測(cè)序數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)材料，通過分組協(xié)作的形式實(shí)踐操作HGAP4[8]、Canu[9]和MECAT[10]3個(gè)基因組組裝軟件和QuickMerge[11]整合軟件，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行整合、得到最終的基因組序列，通過實(shí)踐培養(yǎng)學(xué)生的參與意識(shí)、團(tuán)隊(duì)協(xié)作意識(shí)、動(dòng)手能力和獨(dú)立思考能力等。

1 教學(xué)內(nèi)容

本次開放實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容：HGAP4、Canu和MECAT對(duì)天麻褐腐病菌基因組的組裝及QuickMerge整合組裝結(jié)果得到最終基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)及實(shí)踐。首先教師對(duì)每個(gè)軟件的使用方法進(jìn)行講解，然后按4人一組，共計(jì)6組進(jìn)行實(shí)踐操作。由于基因組組裝需要時(shí)間，所以需要安排4次實(shí)驗(yàn)才能完成（HGAP4、Canu、MECAT和QuickMerge各1次），每次4學(xué)時(shí)，共計(jì)16學(xué)時(shí)。

各軟件操作過程如下：

HGAP4：（1）在 瀏 覽 器 中 輸 入192.168.1.107網(wǎng)址進(jìn)入HGAP4操作網(wǎng)頁；（2）依次點(diǎn)擊Data Management、VIEW OR IMPORT SEQUENCE DATA和IMPORT菜單上傳測(cè)序數(shù)據(jù)；（3）鼠標(biāo)點(diǎn)擊SMRT Analysis選項(xiàng)，在Analysis Application分析菜單中選擇HGAP4，在Genome Length對(duì)話框3中輸入50Mb，點(diǎn)擊START開始程序運(yùn)行；（4）HGAP4.fasta文件即為基因組組裝結(jié)果。

MECAT：（1）在Linux命令行中輸入mecat2pw -j 0 -d su.fq -o su.fq.pm.can -w dir -t 80檢測(cè)重疊群候選對(duì)象；（2）在Linux命令行中輸入mecat2cns -i 0 -t 80 su.fq.pm.can su.fq filtered矯正候選重疊群；（3）在Linux命令行中輸入extract_sequences filtered 100x.fa 50m獲得矯正后的最長測(cè)序reads序列；（4）在Linux命令行中輸入mecat2canu -trim-assemble genomeSize=50m -p QK8 -d QK8 maxThreads=80 -pacbio-corrected 100x.fa進(jìn)行基因組組裝。最后獲得的mecat.fa文件即為基因組組裝結(jié)果。

Canu：直接在Linux命令行中輸入canu -p canu_out genomeSize=50m maxThreads=50 -pacbio-raw su.fa命令進(jìn)行基因組組裝，canu.fa文件即為基因組組裝結(jié)果。

QuickMerge：在Linux命令行中輸入merge_wrapper.py -l 10000 -ml 5000 canu.fa mecat.fa命令進(jìn)行不同軟件基因組組裝結(jié)果整合。

2 實(shí)驗(yàn)實(shí)踐結(jié)果

以在實(shí)踐過程中第2組學(xué)生通過HGAP4、Canu和MECAT對(duì)天麻褐腐病菌Fusarium oxysporum的基因組組裝，并通過QuickMerge軟件整合組裝結(jié)果為例。學(xué)生通過HGAP4組裝獲得50.08Mb的基因組序列，其中序列條數(shù)為20條，N50為4.26Mb（此值越大組裝效果越好）；通過Canu組裝獲得由36條序列組成，N50為3.13Mb，基因組大小為50.52Mb；MECAT拼接獲得由20條序列組成大小為50.25 Mb的基因組序列。通過QuickMerge軟件將3個(gè)拼接軟件的組裝結(jié)果整合后獲得由14條序列組成的大小為50.42Mb的基因組序列，N50為4.52Mb（見表1），其他小組的實(shí)踐結(jié)果與之相同，由此可見學(xué)生獲得了很好的基因組序列，說明天麻褐腐病菌的基因組序列組裝成功。

表1 不同組裝軟件天麻褐腐病基因組組裝結(jié)果比較

3 實(shí)踐教學(xué)成效

3.1 有利于提升學(xué)生對(duì)《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》的學(xué)習(xí)興趣

通過本次開放實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及實(shí)踐，讓學(xué)生更加生動(dòng)地了解到《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》課本中未涉及的學(xué)習(xí)內(nèi)容，讓學(xué)生了解了基因組測(cè)序的目的及發(fā)展過程，了解真菌基因組研究在解決農(nóng)業(yè)、生物能源、醫(yī)藥衛(wèi)生、酶生物技術(shù)和生態(tài)多樣性等方面的重要作用，進(jìn)而激發(fā)學(xué)生對(duì)《農(nóng)業(yè)微生物學(xué)》的學(xué)習(xí)興趣[12-13]。

3.2 有利于提高學(xué)生的實(shí)踐和分析能力

通過對(duì)HGAP4、Canu、MECAT和QuickMerge軟件的實(shí)踐操作以及對(duì)各個(gè)軟件輸出結(jié)果的整理展示，大大提升了學(xué)生的動(dòng)手能力；通過認(rèn)知每個(gè)輸入?yún)?shù)的意義及用途，提升學(xué)生的分析能力；通過認(rèn)知輸出結(jié)果的每個(gè)指標(biāo)如N50、Seq Count和Total Size判斷基因組組裝結(jié)果的好壞，提升學(xué)生的判斷能力[14-16]。

3.3 有利于在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中進(jìn)行推廣

基因組研究是目前各領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，本次設(shè)定的開放實(shí)驗(yàn)屬于生物信息學(xué)范疇，對(duì)于很多只了解理論知識(shí)和基本概念而未進(jìn)行過實(shí)際操作的學(xué)生具有重要意義。由于該實(shí)驗(yàn)只涉及服務(wù)器和學(xué)生的筆記本電腦，不需要購買其他實(shí)驗(yàn)耗材，相較其他實(shí)驗(yàn)而言簡單且具備可操作性，開設(shè)該課程實(shí)驗(yàn)?zāi)苁箯V大本科生受益。在此基礎(chǔ)上探索設(shè)計(jì)其他基因組分析相關(guān)的開放性實(shí)驗(yàn)，如基因組注釋和比較基因組研究等內(nèi)容。

4 實(shí)踐教學(xué)總結(jié)

通過教學(xué)實(shí)踐總結(jié)發(fā)現(xiàn)，所分成的6個(gè)實(shí)驗(yàn)小組中，僅第2和第6組根據(jù)所講內(nèi)容和步驟自主完成相關(guān)的基因組組裝和整合工作，第1、3、5組在教師的指導(dǎo)下完成，第4組未能順利完成實(shí)驗(yàn)。無論能否順利完成實(shí)驗(yàn)，學(xué)生都從中學(xué)習(xí)到了有關(guān)基因組組裝的知識(shí)和分析技能，為后續(xù)從事基因組分析工作奠定了良好的基礎(chǔ)。