右美托咪定抑制高糖誘導心臟成纖維細胞激活的機制研究

單躍 徐利麗 周其富

右美托咪定是一種在臨床上廣泛使用的麻醉藥物，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮等作用，目前也應用于ICU內(nèi)氣管使用呼吸機輔助呼吸患者的鎮(zhèn)靜。右美托咪定對包括心臟、腎臟、肺、肝臟等多種器官具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡的作用。在心血管領域，一項Meta分析結果顯示，對于行外科心臟手術的患者，右美托咪定具有保護心肌細胞和抗炎的作用[1]。但是右美托咪定作為一種常用的鎮(zhèn)靜類藥物，其是否具有抑制高糖誘導的心臟損傷作用，目前報道較少。

在各種病理因素作用下，心臟成纖維細胞由靜止型活化為激活型，增殖和遷移能力增加，并開始大量分泌金屬基質蛋白酶2和抗金屬基質蛋白酶1等影響細胞外基質動態(tài)平衡的蛋白酶，造成心臟間質的纖維化，最終導致心肌重構[2]。在心臟成纖維細胞的激活過程中平滑肌細胞抗體（SMα）、人轉錄因子21（Tcf21）等蛋白的表達增加，在后續(xù)研究中常檢測SMα和Tcf21表達量來鑒別心臟成纖維細胞的激活強度[3]。前期研究中發(fā)現(xiàn)高糖導致的心臟成纖維細胞激活是高糖損傷心臟的重要環(huán)節(jié)[4]。本研究通過右美托咪定干預高糖誘導的心臟成纖維細胞激活模型，探索右美托咪定對心臟的保護作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 心臟成纖維細胞購自湖北普諾賽生命科技有限公司；右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司；FBS、胰酶購自美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖、PBS購自杭州吉諾公司；二苯基溴化四氮唑藍（MTT）、胸腺嘧啶核苷（EdU）購自美國Emresco公司；Transwell小室購自美國康寧公司；二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Rcohe公司；TRIzol RNA試劑盒、逆轉錄試劑盒購自美國 Invitrogen公司；SMα、Tcf21、性別決定區(qū) Y框 4（SOX4）抗體購自美國Abcom公司；辣根過氧化酶及FITC標記的二抗購自美國Jackson公司；Western blot相關試劑購自江蘇碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 將心臟成纖維細胞分為對照組、高糖組和右美托咪定組（Dex組）3組。對照組細胞培養(yǎng)基內(nèi)不加任何干預藥物，高糖組加入30 mmol/L葡萄糖，Dex組加入30 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L右美托咪定。

1.2.2 細胞形態(tài)觀察 將4～7代的心臟成纖維細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于6孔板，每孔接種1×106個細胞，待細胞貼壁后，上述各組加入相應干預藥物，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，每12 h光鏡下觀察記錄各組細胞形態(tài)。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 （1）MTT法：將上述消化后的心臟成纖維細胞以每孔6×103個接種于96孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后，上述各組加入相應干預藥物，置于37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)12、24、48 h。干預結束后，每孔加入MTT液20 μl，孵箱中繼續(xù)孵育4 h。吸去培養(yǎng)液，加入150 μl二甲基亞砜溶液，搖晃10 min后酶標儀上檢測各組吸光度（波長490 nm）。實驗重復3次。（2）EdU法：將培養(yǎng)24 h后的細胞再用EdU 100 μl孵育2 h，吸去上清液，4%多聚甲醛固定細胞，加入2 μg/ml的DAPI染細胞核，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下計數(shù)EdU染色陽性（紅色）細胞數(shù)并記錄。實驗重復3次。

1.2.4 細胞遷移能力檢測 （1）細胞劃痕實驗：將4～7代的心臟成纖維細胞消化后接種于6孔板，待細胞長至80%左右后，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化。使用槍頭制造劃痕并吸棄細胞碎片，上述各組加入相應干預藥物，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。每隔4 h光鏡下拍照記錄各組細胞的生長情況，最后采用Image pro plus 6.0軟件計算各組細胞的遷移面積。實驗重復3次。（2）Transwell法：將4～7代的心臟成纖維細胞消化后接種于Transwell小室（0.8 μm）上室，上述各組加入相應干預藥物，下室中加入含血清的完全培養(yǎng)基。細胞于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)12、24 h后，取下并使用PBS清洗Transwell半透膜，使用4%多聚甲醛固定，采用2 μg/ml的DAPI染細胞核，PBS沖洗3次后，熒光顯微鏡下觀察記錄穿膜細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.2.5 SMα、Tcf21和SOX4蛋白表達的檢測 采用Western blot法。各組細胞經(jīng)干預、孵育48 h后，吸去培養(yǎng)液，使用細胞裂解液裂解細胞，提取細胞中的蛋白質。然后每孔加入15 μl蛋白樣品，凝膠電泳后將蛋白轉至PVDF膜，TBST洗膜后使用血清封閉1 h，加入SMα、Tcf21和SOX4一抗，4℃搖床過夜，TBST洗去一抗后加入二抗常溫孵育2 h，暗室中使用ECL化學發(fā)光法曝光后在柯達膠片上顯影，采用Quantity one軟件定量分析各條帶濃度。實驗重復3次。

1.2.6 SOX4在細胞中的分布及表達 采用細胞免疫熒光法。將各組心臟成纖維細胞加入96孔板，待細胞貼壁后上述各組加入相應干預藥物，孵育48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗后使用4%多聚甲醛固定細胞，加入0.25%Triton溶液破壞細胞膜，加入山羊血清封閉，1 h后加入SOX4一抗，4℃搖床過夜，TBST洗去一抗后加入熒光標記的二抗常溫孵育2 h，TBST清洗后使用熒光顯微鏡拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組心臟成纖維細胞形態(tài)的比較 光鏡下，對照組心臟成纖維細胞細長，呈典型的“梭形”，高糖組細胞失去細長的形態(tài)，逐漸變短、變圓，Dex組細胞恢復細長的梭狀形態(tài)，見圖1。

圖1 3組光鏡下心臟成纖維細胞形態(tài)（a：對照組；b：高糖組：c：Dex組；×200）

2.2 3組心臟成纖維細胞增殖能力比較 MTT和EdU實驗結果顯示，與對照組比較，高糖組心臟成纖維細胞增殖明顯（P＜0.05）；與高糖組比較，Dex組細胞增殖能力降低（P＜0.05），見圖2（插頁）、3。

圖2 3組心臟成纖維細胞EdU實驗染色結果

圖3 3組心臟成纖維細胞增殖能力比較（a：3組細胞EdU染色陽性細胞百分比的比較；與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，△P＜0.05；b：3組細胞MTT實驗結果的比較）

2.3 3組心臟成纖維細胞遷移能力的比較 細胞劃痕和Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，高糖組細胞遷移能力增加（P＜0.05）；與高糖組比較，Dex組細胞遷移能力降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 3組心臟成纖維細胞遷移能力比較（a：細胞劃痕實驗結果；b：3組細胞遷移面積的比較；c：3組細胞穿透膜細胞數(shù)量的比較；d：Transwell實驗結果，DAPI染色，×200）

2.4 3組心臟成纖維細胞中SMα和Tcf21的表達比較 Western blot結果顯示，與對照組比較，高糖組細胞中SMα和Tcf21相對表達量均增加（均P＜0.05）；與高糖組比較，Dex組細胞中SMα和Tcf21相對表達量均減少（均P＜0.05），見圖5。

圖5 3組心臟成纖維細胞中SMα和Tcf21表達的比較（a：3組細胞SMα和Tcf21表達的電泳圖；b：3組細胞SMα相對表達量的比較；c：3組細胞Tcf21相對表達量的比較）

2.5 3組心臟成纖維細胞中SOX4表達比較 細胞免疫熒光染色結果顯示心臟成纖維細胞中SOX4少量表達，高糖能促進心臟成纖維細胞中SOX4表達；與高糖組比較，Dex組細胞中SOX4表達減少，見圖6（插頁）。Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，高糖組細胞中SOX4表達增加（P＜0.05）；與高糖組比較，Dex組細胞中SOX4表達減少（P＜0.05），見圖7。

圖6 3組心臟成纖維細胞SOX4表達和分布（免疫熒光染色）

圖7 3組心臟成纖維細胞SOX4表達（a：3組心臟成纖維細胞SOX4表達電脈圖；b：3組心臟成纖維細胞SOX4表達量比較；與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，△P＜0.05）

3 討論

在正常心臟組織中，心臟成纖維細胞處于“靜息”狀態(tài)，其主要起構成心臟網(wǎng)狀纖維結構的作用。靜止型心臟成纖維細胞外觀呈“梭形”，增殖和遷移能力弱[2]。當受到各種炎癥介質、細胞因子、物理張力等病理因素刺激的作用下，靜止型的心臟成纖維細胞被激活，轉化成激活型的成纖維細胞，最終導致心臟重構，影響心臟的收縮和舒張功能。激活型的細胞具有以下特點：（1）各種促炎和促纖維化因子表達水平升高，直接促成炎癥細胞浸潤和成纖維細胞增殖；（2）分泌高水平的基質金屬蛋白酶以促進成纖維細胞遷移；（3）促進膠原蛋白和其他血管基底膜蛋白的沉積，導致瘢痕形成；（4）表達SMα、Tcf21等特異性的標志蛋白[5-8]。有研究發(fā)現(xiàn)高糖通過誘導葡萄糖轉運蛋白1的表達從而促進心臟成纖維細胞的激活[9]。

隨著糖尿病發(fā)病率的不斷上升，氣管插管在長期使用呼吸機的糖尿病患者中比例不斷提升。插管患者使用的麻醉鎮(zhèn)靜藥物是否具有減少高糖對全身器官組織的損傷是目前學術界的研究熱點。Iida等[10]研究結果顯示丙泊酚可以抑制血小板衍生生長因子誘導的血管平滑肌細胞遷移。Sun等[11]研究表明麻醉藥物咪達唑侖可以通過調(diào)節(jié)miR-194-5p/HOOK3軸降低非小細胞肺癌細胞對順鉑的耐藥性，從而提高藥物的化療效果。在心血管領域中，Ok等[12]研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可以通過激活PKC途徑，誘導肌球蛋白磷酸酶抑制蛋白的磷酸化，提高其鈣離子敏感性，最終增加心臟的收縮能力。與上述研究結果相符，本研究使用右美托咪定干預高糖誘導的心臟成纖維細胞激活模型，發(fā)現(xiàn)右美托咪定不僅可以抑制高糖誘導的心臟成纖維細胞增殖和遷移，同時還可以抑制心臟成纖維細胞中SMα、Tcf21等心臟成纖維細胞激活特異性標志蛋白的表達，表明右美托咪定具有抑制高糖誘導心臟成纖維細胞激活的作用。上述結果提示對于長期使用呼吸機的糖尿病患者，使用右美托咪定鎮(zhèn)靜麻醉可能具有保護高糖引起心臟損傷的作用。

SOX4基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、胸腺、腫瘤等器官組織中都有表達，對包括心肌細胞在內(nèi)的多種細胞的穩(wěn)定和分化具有關鍵的調(diào)控作用。已有研究證明SOX4基因的表達與先天性疾病、心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，靶向抑制SOX4的表達可以降低細胞的增殖能力[13-14]。有研究結果顯示，circHIPK3通過調(diào)節(jié)miR-338-3p的表達，進而增加SOX4在成纖維細胞中的表達量，最終激活成纖維細胞[15]。為了進一步探索右美托咪定是通過何種途徑發(fā)揮其抑制高糖誘導的心臟成纖維細胞激活的作用，本研究通過細胞免疫熒光及Western blot檢測了各組細胞中SOX4的表達情況，結果顯示右美托咪定在抑制高糖誘導心臟成纖維細胞激活的同時，可以抑制細胞中SOX4的表達。

綜上所述，本研究右美托咪定干預高糖誘導的心臟成纖維細胞激活模型，發(fā)現(xiàn)高糖組細胞外形變大變圓，失去纖維細胞典型的“梭狀”形態(tài)，細胞增殖和遷移能力增加，細胞中SMα、Tcf21和SOX4的表達增加，而右美托咪定可以減弱高糖對心臟成纖維細胞的上述影響，筆者推測右美托咪定可能是通過抑制SOX4表達，從而發(fā)揮抑制高糖誘導心臟成纖維細胞激活的作用。本研究僅從細胞層面驗證了上述結果，并沒有在體層面證實，這是本研究的一大局限。