MALDI-TOF MS快速檢測陽性血培養中腸桿菌目細菌碳青霉烯酶活性的評價

梁世周 許建平 蔡文品 孔萬仲 奚經巧 金曉立 曾云祥

血流感染的治療是全世界醫療衛生機構的臨床重點，有報道其致死率為18.2%～21.4%[1]。有研究結果顯示，對于膿毒性休克患者，如果每延遲1 h給予有效治療，死亡風險增加35%[2]。因此，早期適當使用抗生素治療對改善血流感染的預后至關重要[3]。目前，腸桿菌目菌株是引起血流感染的主要病原體，其分離率高達30%[4]。同時，近年來耐碳青霉烯腸桿菌目對全球公共衛生構成的威脅呈指數級增長，成為最常見的一個全球衛生問題[5]。中國細菌耐藥監測網（CHINET）顯示，2005—2019年36所三級醫院肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率從3.0%上升至25.3%，且呈逐年遞增趨勢[6]。此外，耐碳青霉烯類藥物的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，已成為近年來死亡率上升最快的病原菌[7]。在腸桿菌目中，碳青霉烯類耐藥性通常是由于諸如外排泵、孔蛋白損失和產生大量耐藥酶等過程導致的，其中產碳青霉烯酶是最常見的耐藥機制。因此，耐藥酶的快速檢測成為近年來的熱點研究領域。

目前，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是碳青霉烯酶活性檢測的最新進展，被成功地用于從革蘭陰性菌落中直接檢測碳青霉烯酶的活性[8-10]。筆者嘗試利用MALDI-TOF MS直接從陽性血液培養瓶中對腸桿菌目細菌生產的碳青霉烯酶活性進行快速檢測，并與耐藥基因PCR分子檢測結果比較，評估該方法的可靠性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月至2018年12月溫州市中醫院各臨床科室分離的腸桿菌目細菌46株，不含重復菌株。其中產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌（carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，CPE）25株，包括攜帶 blaKPC-27株，blaNDM（包括NDM-1、4、5型）8株，blaIMP-42株，同時攜帶blaKPC-2和blaCTX-M4株，同時攜帶blaKPC-2和blaNDM-42株，同時攜帶blaNDM-1和blaIMP-42株；非產碳青霉烯酶腸桿菌目細菌（non-carbapenemase-producing Enterobacteriaceae，NCPE）21株 ，其 中 攜 帶blaCTX-M5株，未檢測到上述基因型且碳青霉烯類敏感的腸桿菌目細菌16株。篩查2022年3月至4月本院各病房送檢已簽發報告的陽性血培養標本，收集致病菌為耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（carbapenemase-resistant Enterobacteriaceae,CRE）9例，非耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌（non-carbapenemase-resistant Enterobacteriaceae,NCRE）17例，對上述26例血培養樣本打亂順序，作為方法驗證的臨床樣本。質控菌株選用大腸埃希菌ATCC?25922和肺炎克雷伯ATCC?BAA1706作為陰性對照，肺炎克雷伯ATCC?BAA1705作為陽性對照，均購自浙江省臨床檢驗中心。

1.2 主要試劑和儀器 全自動快速生物質譜檢測系統（Bruker autoflexTMMALDI-TOF MS）及相關配套試劑（德國布魯克科技有限公司），血培養瓶、Vitek2 Compact細菌鑒定與藥物敏感儀及相關配套試劑（法國梅里埃生物科技有限公司），血瓊脂平板（鄭州安圖生物股份有限公司），1.5 ml EP管若干，亞胺培南標準品（湖北惠擇普醫藥科技有限公司,CAS號：64221-86-9），十二烷基硫酸鈉（天津北辰方正化工），真空采血管（美國BD公司），高速離心機（美國賽默飛世科技公司），萬分之一天平（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定和藥敏試驗 采用Vitek2 Compact做細菌鑒定和藥敏試驗，結果解釋參照CLSI M100 S31標準[12]。

1.3.2 耐藥基因檢測 采用煮沸法提取細菌DNA模板。PCR體系50 μl，2×PCR Master Mix 25 μl，上、下游引物 10 μmol/L 各 1 μl，模板 DNA 2 μl，滅菌水 21 μl。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72℃45 s，30個循環；72℃延伸5 min。再取PCR擴增物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍攝。詳細步驟及引物設計參照文獻[11]。

1.3.3 模擬陽性血培養 復融上述菌株于血平板中，過夜培養18 h。挑取少許菌落溶于無菌0.9%氯化鈉溶液中，配制成0.5麥氏濃度菌懸液（相當于1.5×108CFU/ml），稀釋至1×103CFU/ml。在輸血科收集報廢O型懸浮紅細胞和O型血漿，混合制成紅細胞壓積（Hct）約為0.4的模擬人血液。取1 ml上述菌懸液混于9 ml人模擬血液，注入血培養瓶中，放置血培養儀等待報陽后取出備用。

1.4 血培養液前處理

1.4.1 制備菌懸液 用注射器抽取報陽后的血培養液5 ml，置于真空采血管內，1 170 r/min，離心5 min，將紅細胞沉置分離膠下部，棄上清液。加入0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液1 ml洗滌，用旋渦振蕩器混勻后，再次1 170 r/min，離心5 min。該洗滌步驟重復進行2次，棄上清液，加入0.9%氯化鈉溶液1 ml復混，獲得單一的菌懸液備用。

1.4.2 菌株鑒定 于EP管中分別加入150 μl上述菌懸液和450 μl無水乙醇，混勻后16 000 r/min，離心2 min，棄上清液后加入20 μl 70%甲酸溶液和20 μl乙腈，混勻，再次 16 000 r/min，離心 2 min。取上清液 1 μl，點靶；干燥后滴加1 μl基質液（α-HCCA），晾干后上機。

1.4.3 亞胺培南分解試驗 利用萬分之一天平稱取10 mg亞胺培南和20 mg SDS溶于10 ml 0.9%氯化鈉注射液中，配制成0.2%SDS、1.0 mg/ml亞胺培南混合液，備用。吸取30 μl上述混合液于EP管中，再加入30 μl菌懸液，混勻后放置37℃水浴箱2 h。隨后，將EP管16 000 r/min，離心2 min，取上清液 1 μl，點靶；干燥后滴加1 μl基質液，晾干，上機。

1.5 MALDI-TOF MS分析及結果判定 質譜儀采用反射正離子模式，手動采集光譜，采集區間為100～600Da；參數設置：離子源1∶10.00 kV；離子源2∶9.08 kV；鏡頭：3.00 kV；脈沖離子提取時間：10 ns；激光頻率：60.0 Hz。應用flexControl 3.3軟件(Bruker Daltonics)分析所得光譜。

菌種鑒定收集2 000～20 000 Da的光譜，用BTS進行儀器校準，通過軟件IVD MALDI Biotyper 3.1版識別菌名，并且以軟件給出的Biotyper log值評價鑒定效果：分值≥2.0視為鑒定到種水平，1.70～1.99視為鑒定到屬水平，分值＜1.70視為不可信結果。

通過觀察亞胺培南（Imipenem:C11H17N3O4S,相對分子質量：299.35 g/mol）產生的質譜峰[Imipenem+H+]:300 m/z、亞胺培南和基質液混合物[Imipenem+α-HCCA+H+]：489 m/z質譜峰，兩處峰完全消失，判定為試驗菌產生可以分解亞胺培南的碳青霉烯酶。

1.6 方法驗證 對上述26株臨床陽性血培養樣本按照1.3～1.4步驟操作。

1.7 質量控制

1.7.1 質譜峰校準 利用基質液中α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-HCCA：C10H7NO3,相對分子質量189.17 g/mol）電離產生的質譜峰對波峰采集區間0～600 Da進行校準，校準峰分別為 HCCA_[M+H+]：190.050 m/z、HCCA_[M+Na+]：212.032 m/z和 HCCA_[2M+H+]：379.092 m/z，3個校準峰值同時出現，并且每個峰的最大偏差（Err/ppm）都不超過±100 ppm，即視為校準通過[14]。同時，把α-HCCA的質譜峰作為空白實驗對照。

1.7.2 藥物對照 取0.5 g/ml亞胺培南混合0.1%SDS溶液1 μl點靶干燥后滴加基質液，上機后收集的質譜峰作為此次實驗的藥物對照。

1.7.3 陰陽性對照 以大腸埃希菌ATCC?25922和肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1706作為不產碳青霉烯酶的陰性對照株，肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1705作為產KPC的陽性對照株，按照上述實驗流程檢測。

1.8 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以表示；使用Kappa對質譜法結果和原先檢出的基因檢測結果進行一致性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 質譜峰校準分析 經校準，質譜儀內部校準通過，見圖1a。圖1b中300 Da處為亞胺培南分子電離產生的質譜峰，和約為489 Da處由亞胺培南與HCCA混合物形成的質譜峰，以及SDS（C12H25SO4Na，相對分子質量：288.38）分子_[SDS+Na+]:311 Da處的質譜峰。

圖1 質譜校準峰、亞胺培南和SDS質譜峰示意圖

2.2 藥敏及質譜結果 本實驗共收集CPE 25株和NCPE 21株，包含5種腸桿菌目細菌，攜帶碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaIMP-4和blaNDM及β內酰胺酶blaCTX-M，見表1。藥敏結果顯示，25株CPE對亞胺培南和厄他培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為4～≥16不等，另外21株NCPE的MIC為≤0.5～2。陽性血培養液提純菌液的直接細菌鑒定結果同之前純菌落鑒定結果完全一致，軟件給出的Biotyper log值為2.188±0.102，種水平鑒定率為96.0%，屬水平鑒定率為100.0%。在亞胺培南水解試驗中，結果顯示：25株CPE生成的質譜圖均未出現300 m/z和489 m/z處的質譜峰，提示亞胺培南已被完全水解。而21株NCPE則全部檢測到300 m/z和489 m/z的質譜峰，見圖2。應用一致性檢驗結果Kappa=1，提示兩種方法高度一致。

表1 49株腸桿菌目PCR、藥敏及血培養液直接檢測的質譜結果

圖2 10例300 m/z和489 m/z處的質譜峰消存情況（a：空白對照；b：藥物對照；c:肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1705；d：肺炎克雷伯菌ATCC?BAA1706；e：產KPC-2肺炎克雷伯菌；f：產IMP-4植生拉烏爾菌；g：產NDM-1陰溝腸桿菌；h：產KPC-2和NDM-4肺炎克雷伯菌；i:產CTX-M肺炎克雷伯菌；j：無攜帶耐藥基因的大腸埃希菌）

2.3 質譜圖結果 所有質譜圖結果均表現為300 m/z和489 m/z同時存在或同時消失，未出現兩處峰結果不一致的結果。同時311 m/z處由SDS生成的質譜峰均高于300 m/z處質譜峰，且十分穩定。

2.4 方法驗證結果 驗證結果顯示，其中有17例出現300 m/z和489 m/z處質譜峰，且均對應17株碳青霉烯類藥物敏感的菌株。剩下9例未出現這兩處質譜峰，對應9株耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌目病原菌。統計結果顯示其靈敏度和特異度均為1.00。

3 討論

目前，根據CLSI和EUCAST指南，臨床實驗室應報告碳青霉烯類藥物的敏感性，而在確認碳青霉烯酶的產生未做必要性要求。因此，自動化系統習慣性地忽視碳青霉烯酶的檢測。近年來，針對CPE可以有效且快速分解亞胺培南的特性，通過飛行時間質譜技術捕捉亞胺培南所顯示的特征譜峰，檢測其水解情況，從而判斷碳青霉烯酶活性的方法逐漸被開發。而本實驗證實，該方法同樣適用于在陽性血培養液中對CPE的檢出。

本實驗篩選46株經確定常見碳青霉烯酶基因型的細菌，模擬血培養報陽后，再經MALDI-TOF MS直接對血培養液做細菌鑒定和亞胺培南水解實驗。結果顯示，質譜檢測21株CPE的結果均未檢測到300 m/z和489 m/z處的質譜峰，而25株NCPE則均可檢測到，對比基因表型高度一致。此外，對血培養液直接鑒定的細菌種水平鑒定率為96.0%。該數據與國外相關報道接近[13-14]。

在質譜圖方面，本實驗選擇300 m/z和489 m/z兩處質譜峰作為結果的判斷，旨在避免因為細菌自身蛋白或其他雜質造成300 m/z或489 m/z任一處出現假性藥物峰的錯誤判讀[15]。因為一旦出現這兩處峰的結果不一致，實驗人員可以對結果質疑并重新評估。然而，本實驗均未出現該情況。此外，311 m/z處由SDS產生的質譜峰極其穩定，且表現出相較其他譜峰更高的分辨率。SDS在實驗中作為去污劑和表面活性劑，分別在血培養液的洗滌和上清液點靶后的快速干燥上起相應作用。通過涂片在顯微鏡下發現，未加入SDS洗滌的血培養液攜帶豐富的雜質，而這些雜質將會使下一步細菌鑒定的Biotyper log值下降0.5分以上（數據未顯示）。并且，SDS的陰離子表面活性劑功能可以改變液體表面張力，從而克服上清液在靶板上干燥慢的缺陷。有研究表明，補充SDS在任何情況下都不會改變抗生素峰譜[15]，本實驗中也得以證實。

本研究選擇亞胺培南作為水解底物，其相較于美羅培南和厄他培南，具備水解時間快[8]，獲得的質譜峰通常更清晰，使結果更易判讀[16]等好處。但是，在本實驗中未發現亞胺培南降解產物對應的峰，即使是重復的孵化和測量也沒有獲得更好可解釋的結果。這一點與相關報道一致[13,16]。這可能與其水解產物的不穩定性有關[15]，但目前尚未被證實。在本團隊前期實驗中發現，部分梅里埃生產的血培養瓶中含有碳粒成分，這對微生物蛋白的提取及純化影響較大，不宜進行直接鑒定。然而，由于菌株收集有限，本研究只局限對腸桿菌目細菌的檢測，未納入非發酵菌，這點將在后續的研究中改進。

綜上所述，MALDI-TOF MS可以直接從血培養液中鑒定病原菌及檢測碳青霉烯酶活性，且表現出極好的靈敏度和特異度，這或將對臨床及早調整抗菌藥物治療和實施感染控制措施提供值得期待的應用前景。