亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態性與亞洲人群多囊卵巢綜合征風險相關性的Meta分析

孫爽 劉穎 趙迅 郭雪華 于婷婷

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是一種異質性和復雜的疾病，被認為是育齡婦女最常見的內分泌疾病之一，也是不孕癥的主要原因[1-2]。PCOS的累積患病率為6%～17%，臨床主要表現為月經周期不規則（閉經、月經過少或慢性無排卵），雄激素水平過高，超聲檢查顯示無排卵導致不孕和多囊卵巢形態（卵巢腔前卵泡過多）[3-4]。PCOS的發病與多種易感基因、環境因素及其相互作用有關，現有資料表明，亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenete trahydrofolate reductase,MTHFR）是PCOS發生、發展的重要基因因素之一。MTHFR是導致高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia,Hhcy）的最常見原因，進而導致PCOS相關冠心病（coronary atherosclerotic heart disease,CAD）的發生[5]。MTHFR是一種葉酸依賴性酶，在葉酸代謝的DNA合成途徑向DNA甲基化途徑中發揮中心作用，而這一途徑在細胞復制和基因表達中起重要作用。C677T是編碼MTHFR催化結構域的基因中最常見的多態性表現。外顯子4核苷酸677處的胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）替換導致MTHFR最終降低或喪失活性，進而導致Hhcy，尤其是葉酸、維生素B6和B12缺乏的患者高半胱氨酸血癥更為嚴重[6]。關于MTHFR C677T多態性的系統綜述，特別是針對亞洲人群，尤其是中國人群的報道較少。因此，筆者對亞洲人群PCOS與MTHFR C677T多態性的關系進行Meta分析，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 搜索PubMed、EMBASE、萬方和CNKI數據庫，截止時間為2021年9月1日。使用中文數據庫中術語“亞甲基四氫葉酸還原酶”（或“MTHFR”）、“多態性”（或“polymorphism”）和“多囊卵巢綜合征”（或“PCOS”）以及相關中英文關鍵詞的各種組合來篩選相關研究。納入標準：（1）評估亞洲人群MTHFR C677T多態性與PCOS風險之間的相關性；（2）病例對照研究和全文文章；（3）有足夠的基因型數據可用于計算95%CI和OR值；（4）針對人體的研究。如果研究包括重疊的受試者，則只選擇樣本量較大的研究。排除標準：（1）非病例對照研究；（2）無足夠的數據報告；（3）非亞洲人群；（4）病例報告或回顧性分析。此外，手動搜索收錄文章和綜述文章的參考文獻列表，以檢索其他文章。

1.2 數據提取 由2位作者依據標準化入選方案分別從所有符合入選標準的文章中提取相關數據。若有分歧通過與第3位作者討論進行解決。從每項研究中提取以下信息：第一作者的姓氏、發表年份、來源國、人群、對照來源、病例和對照的樣本量、基因型數量、Hardy-Weinberg平衡（HWE）的P值、基因分型方法。

1.3 納入文獻的質量評價 根據紐卡斯爾-渥太華量表（New castle-ottawa scale，NOS）對每個納入研究的病例和對照的選擇、基于研究設計所得的病例與對照的可比性、暴露評價等3個方面進行質量評估，每個方面分別由4項、2項和3項組成。該量表包含9個項目，每個項目的分值為1。NOS評分是一種廣泛使用的評估Meta分析觀察性研究質量的評級系統，6星或以上表示研究質量高[7]。

1.4 統計學處理 采用Stata 12.0統計軟件。采用χ2檢驗計算HWE。在等位基因模型（T比C）、顯性模型（TT+CT比CC）、隱性模型（TT比CT+CC）和純合模型（TT比CC）下，采用具有相應95%CI和OR值來評估MTHFR C677T多態性與PCOS之間的關系。與累積值相關的顯著性通過Z檢驗確定；研究間異質性的評估使用Cochrane Qtest，并使用I2統計進行量化。在統計異質性條件下（P＜0.05，I2＞50%），采用隨機效應模型，否則采用固定效應模型[8-9]。敏感性分析是通過逐一去除單個研究來評估合并研究的穩健性。借助Begg漏斗圖和Egger檢驗對潛在發表偏倚進行評估（P＜0.05為顯著的發表偏倚）。此外，通過種族、病因、基因型方法和對照來源進行亞組分析并通過Galbraith作圖，以調查異質性的可能來源。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入研究的一般情況 篩選流程見圖1。通過文獻檢索，共檢索出356篇論文。14例病例對照研究滿足先前提出的納入標準，共評估2 123例PCOS患者和2 061例對照者。在所有14項研究中，6項研究為中國人群，3項研究為印度人群，1項研究為韓國人群，3項研究為伊朗人群，1項研究為南亞人群。5項病例對照研究為基于醫院患者的研究，9項為基于普通人群的研究。納入文獻的特征和NOS質量評價結果見表1。

圖1 納入研究的流程圖

表1 納入文獻的特征和NOS質量評價結果

2.2 MTHFR C677T多態性與PCOS易感性的Meta分析 在4個遺傳模型中發現了顯著的異質性（Ph，異質性試驗的P＜0.05），因此應用隨機效應模型。結果表明，MTHFR C677T基因型與PCOS風險之間存在顯著相關性，見表2、圖2。

表2 MTHFR C677T多態性與PCOS相關性的Meta分析

圖2 不同基因模型的森林圖（a：等位基因模型；b：顯性模型；c：隱性模型；d：純合模型）

對于異質性較高（P＜0.05，I2＞50%）的遺傳模型，進行敏感性分析，逐個剔除各模型中所有符合條件的文獻，評估各文獻異質性對整個模型分析的影響。敏感性分析表明，在T vs.C下，排除個體研究不會過度影響MTHFR C677T多態性總的OR值，表明該Meta分析結果的穩健性，見圖3。此外，在所有原始固定模型中對隨機效應模型進行了重新測試，相應的合并OR值沒有實質性改變。Begg漏斗圖未見顯示明顯的不對稱，見圖4。Egger檢驗也沒有證據表明等位基因模型的回顧性研究存在發表偏倚（P＞0.05）。

圖3 亞洲人群MTHFR C677T多態性與PCOS易感性相關性的敏感性分析

圖4 MTHFR C677T基因多態性對PCOS風險影響的漏斗圖

2.3 亞組分析 中國亞組的匯總分析包括來自中國的7項研究，結果發現異質性顯著，因此采用隨機效應模型。在4種基因模型中發現中國人群與PCOS發病風險呈正相關（T比C：OR=1.79，95%CI：1.27～2.51；TT+CT 比 CC：OR=2.29，95%CI：1.36～3.86；TT比 CT+CC：OR=1.97，95%CI：1.34～2.90；TT與CC：OR=2.99，95%CI：1.56～5.74）。然而，在伊朗人群中顯著結果僅出現在T比C（OR=1.59，95%CI：1.19～2.11）和TT+CT比CC（OR=1.75，95%CI：1.23～2.48）之間。此外，由于Meta分析中涉及韓國人群的文章數量有限，因此本研究得出的韓國人群與PCOS風險無關的結果具有一定局限性。

在按基因型方法和HWE分層的亞組分析中，采用PCR-RFLP方法的研究與符合HWE對照組的研究中，MTHFR C677T基因多態性與PCOS具有顯著相關性。此外，結果表明，在中國受試者亞組、PCR-RFLP基因分型方法研究亞組和符合HWE研究亞組中，研究之間的異質性顯著，見表2。

2.4 異質性分析 Galbraith圖：該方法提供圖形顯示，可以直觀地獲得異質性異常點。Choi等[11]、Liang等[20]和Jiang等[21]的研究不在95%CI回歸線內。結果表明，這3項研究是異質性的主要來源，見圖5。

圖5 異質性的Galbraith圖

3 討論

一些薈萃分析調查了不同人群MTHFR C677T多態性與PCOS之間的關系，但結論存在爭議。部分原因可能是人群差異和樣本量小。Bagos等[23]進行了包含6項病例對照研究的Meta分析，結果發現MTHFR C677T與PCOS風險沒有關聯。同樣，Lee等[24]以9項研究為基礎進行Meta分析也未得出具有相關性的結果。然而，Li等[25]對總共10項病例對照研究進行了Meta分析，結果指出MTHFR C677T多態性的T等位基因增加了歐洲人群PCOS的易感性。而Wang等[26]認為T等位基因的存在可能會增加中東人群患PCOS的風險，并降低高加索人群患PCOS的風險。Li等[27]證明MTHFR 677T與PCOS風險增加顯著相關，尤其是在亞洲人群中。

僅針對亞洲人群，迄今已有14項研究評估了MTHFR C677T多態性對PCOS的影響[10-22]。本研究14項病例對照研究為基礎，納入2 123例患者和2 061例對照人群，結果發現亞洲人群MTHFR C677T多態性與PCOS發病風險在4種遺傳模型下存在顯著的相關性。基于這一評估，并與之前的分析不同，筆者發現MTHFR C677T多態性與中國人群PCOS易感性增加顯著相關。這意味著育齡婦女MTHFR酶活性的降低可能導致局部高同型半胱氨酸環境的增加，從而增加PCOS的風險。研究發現，Hhcy可誘發某些疾病，如先天性畸形和心血管疾病[28-30]。同型半胱氨酸（homocysteinemia,Hcy）是一種含硫氨基酸，其代謝受3種關鍵酶的影響，如MTHFR、葉酸和多種維生素[31]。5-亞甲基四氫葉酸是Hcy甲基化的甲基供體。MTHFR在5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-亞甲基四氫葉酸的過程中起著重要作用。因此，MTHFR可以間接調節血漿Hcy水平[32]。MTHFR基因C677T可使最初合成的丙氨酸變為纈氨酸，從而降低酶活性，導致Hcy代謝受阻，最終導致Hhcy[33]。大多數研究表明，純合子（TT）突變受試者的血漿總Hcy水平顯著增加[34-36]。多項研究表明，Hcy水平升高可能與PCOS的發病機制有關[37-41]。先前的一項研究發現，升高的Hcy水平可以通過抑制雌激素來調節M2巨噬細胞極化，從而促進PCOS小鼠的胰島素抵抗和脂肪組織炎癥[41]。一項包含936名參與者的多中心、隨機、對照試驗表明，Hhcy血癥（一種以血液中Hcy水平異常高為特征的疾病）會增加PCOS患者流產的風險并減少排卵[37]。

由于本Meta分析具有顯著的異質性，需要仔細解釋和尋找影響因素。通過亞組分析，人群、基因分型方法、HWE研究和樣本量的差異應被視為異質性的潛在來源。不同人群之間的異質性可能是由以下潛在因素造成的：人口多樣性、不同人群的不同習慣以及導致PCOS易感性差異的環境因素。PCOS是在許多種族中常見的內分泌疾病。在公開的基因組數據庫中，對基因多態性的種族變異性進行的研究表明：PCOS的種族變異在很大程度上取決于人類的遺傳背景[42-43]。此外，筆者推測非中國人群之間的非顯著關聯可能是由于該人群中TT基因型的頻率相對較低。然而，由于這些研究的數量有限，應該慎重解釋研究結果。此外，基于醫院患者的對照比基于人群的對照具有明顯的異質性。一個可能的原因是，基于醫院的對照組具有固有的選擇偏差，而基于人群的對照組在基因型關聯研究中可能更能代表一般人群。

異質性分析顯示Choi等[11]和Liang等[20]、Jiang等[21]的研究為本Meta分析異質性的主要來源，Choi研究等位基因頻率在病例和對照組間的分布不符合HWE。而Liang等[20]、Jiang等[21]研究對照組均選擇了基于醫院患者的對照。病例組與對照組不同的環境暴露、選擇偏差和研究設計。因為遺傳關聯性研究的可靠性和有效性在較大程度上依賴于對照組的正確選擇[44]。

進一步的亞組分析表明，MTHFR C677T多態性與PCOS風險的陽性顯著結果與PCR-RFLP基因型方法相關。當按HWE分組時，筆者發現在符合HWE對照組的研究中顯示陽性結果，而在不符合HWE對照組的研究中顯示陰性結果。HWE與基因型分型質量密切相關，因此，制作遺傳關聯性研究Meta分析時，需要檢驗對照組人群基因型分布是否符合HWE。不符合HWE的研究可能存在基因型分型錯誤、選擇性配對即非隨機配對、選擇偏倚、人群分層即在研究中混合了遺傳學隔離的人群等情況使分析結果出現偏差[45]。

本研究還存在局限性。首先，在總體分析和亞組分析中觀察到顯著的異質性，盡管調查了異質性的幾個潛在來源，包括人群、方法、HWE研究和樣本量，但它們都不能充分解釋研究間的異質性。不同研究人群中的其他未發現因素可能導致檢測到的異質性。第二，MTHFR C677T基因多態性可能與其他因素一起影響PCOS的易感性，但由于數據不足，本研究沒有進行相關研究，如基因-基因和基因-環境相互作用。最后，發表偏倚是可能存在的，因為沒有試圖識別未發表的研究，也沒有以英文或中文發表的研究，這可能導致選擇偏倚。

綜上所述，在總體研究中，亞洲人群中MTHFR C677T多態性與PCOS風險之間存在顯著相關性，尤其是在中國人群中。需要更大樣本量的進一步研究和完善設計的研究進一步調查MTHFR C677T多態性與PCOS風險之間的關聯。