超氧化物歧化酶融合蛋白改善阿爾茨海默病小鼠大腦白質超微結構實驗研究

程 艷，郭建偉，李 揚，薛榮亮

(1.陜西省人民醫院麻醉科，陜西 西安 710068；2.西安國際醫學中心醫院麻醉與舒適化醫療中心，陜西 西安 710100)

體視學方法通過觀察和測量二維切片信息而獲得精確三維定量的顯微結構信息。簡單來講，當三維空間內的立體結構表現在二維切面上時，三維空間體積特征即表現為二維切面上的面積特征，三維空間內表面積在二維切面上表現為邊界線(輪廓)，線性結構無論其在三維空間內怎樣走行，在二維切面上僅僅表現為斷面數(點)。體視學的三維定量研究被國際上公認為生物醫學領域最準確、最精確的三維定量研究方法，許多領域如神經科學、影像學、病理學等廣泛應用此種方法進行有關三維定量的相關研究[1]。然而對于神經纖維的形態學研究較少，尤其是基于方法學設計的體視學研究在神經領域應用較少。幾個基于設計的體視學研究發現阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)海馬組織顯示(不同于正常老化)大量神經元丟失在CA1區[2-5]，這種選擇性的神經元喪失是在臨床前期，即AD患者出現斑塊形成之前發生的，在此期間大腦中有大量淀粉樣蛋白沉積，但沒有認知能力下降的證據[5]。因此，體視學研究在AD中占據著重要位置，其可通過定量測量揭示AD病因或疾病發展過程，為AD治療提供可能的機會。

有研究[6-8]表明，氧化應激產生的大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)及其氧化損傷在許多與神經變性相關疾病(如AD)的發病機制中發揮作用。線粒體也在神經元功能中起關鍵作用，并且這些功能的幾乎所有方面都在AD中發生改變[9]。氧化應激被認為是包括AD在內的廣泛神經系統疾病中神經元損傷的主要原因[10-11]，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是針對ROS的主要抗氧化劑防御系統[12]，分子量大且沒有特異性受體，這使得它難以穿過血腦屏障及細胞膜進入腦內發揮作用。本課題組前期構建了pET16b-PTD4-Cu、Zn-SOD重組表達載體并進行優化，其表達蛋白(SOD融合蛋白)表現出特定的跨膜能力，可以進入體外培養的人星形膠質細胞[13-16]。因此，本研究擬通過現代體視學方法探究SOD融合蛋白對AD小鼠腦白質(White matter，WM)及其超微結構的影響，以為AD抗氧化治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用32只健康清潔、體重30～35 g的昆明雄性小鼠(購自西安交通大學動物實驗中心)，飼養于恒定溫度(23±1)℃、恒定濕度(60±10)%和12 h明暗周期的無病原體環境中，飲用水和食物不受限制。本實驗根據《實驗動物的護理和使用指南》進行動物飼養和處理，并通過西安交通大學動物實驗倫理審查。

1.2 主要試劑 β-淀粉樣蛋白(Aβ)1-42蛋白寡聚體(107761-42-2，上海吉爾生化有限公司)；PBS干粉(PW013，西安赫特生物科技有限公司)；多聚甲醛(PI014，西安赫特生物科技有限公司)；瓊脂粉(Q-0024796，法國Biowest生物有限公司)；青霉素(西安交通大學第二附屬醫院藥劑科)；苦味酸(汕頭西隴化工公司)；10%水合氯醛、25%戊二醛水溶液及0.9%氯化鈉溶液(實驗室配制)；75%乙醇消毒液及雙蒸水(實驗室提供)。

1.3 小鼠分組及實驗流程 32只昆明雄性小鼠適應性飼養7 d后，根據隨機數字表法分為假手術組(S組)、模型組(M組)、SOD干預模型組(SM組)和SOD融合蛋白干預模型組(PM組)，每組8只。在實驗第9～23天，通過小鼠連續腹腔內注射等量0.9%氯化鈉溶液(S組和M組)、6 mg/(kg·d) SOD(SM組)或6 mg/(kg·d) SOD融合蛋白(PM組)進行預防干預。其中，在實驗第16天，通過5 μl微量注射器將0.9%氯化鈉溶液(S組，2 μl/只)及Aβ1-42寡聚體(M組、SM組及PM組，2 μl/只)注射于小鼠右側腦室，以制備AD模型。在第32天，隨機選取一側大腦半球用ELISA法測定腦組織勻漿中的SOD活力和丙二醛(MDA)水平，另一側大腦半球固定于2%甲醛+2.5%戊二醛溶液中，應用現代體視學方法定量分析小鼠腦白質及其超微結構變化。

1.3.1 立體定位腦室內Aβ1-42輸注：4%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將其背位固定于腦立體定位儀(SR-5，Narishige)上。參考George Paxinos等編著的《小鼠腦立體定位圖譜》，選定并標記小鼠右側腦室的進針點，即由前囟向后0.45 mm、矢狀縫向右側1.0 mm的位置，在標記的進針點處進行顱骨鉆孔，將5 μl微量注射器自硬膜下垂直進針2.0 mm，緩慢注射2 μg Aβ1-42寡聚體于側腦室中。注射完畢后，留針20 min后緩慢拔出微量注射器，縫合頭頂皮膚。再次消毒手術區域后，每只小鼠肌注青霉素約2萬單位，歸籠，嚴密監測小鼠呼吸是否正常。

1.3.2 標本取材：仰臥位固定并麻醉小鼠，夾起胸部靠近劍突下的皮膚，剪開胸腔皮膚和肋骨，并剪開膈肌，充分暴露小鼠心臟與肝臟。夾起室間隔靠近右心室處，將輸液器鋼制針頭插入小鼠左心室并用動脈夾妥善固定，然后剪開右心耳流出血液，打開輸液器控制閥灌注0.9%氯化鈉溶液，10 min左右血液完全排出后可觀察到小鼠肝臟及四肢發白，此時即表示灌注良好。將小鼠頭部皮膚剪開，露出顱骨，剝開頭蓋骨，輕柔剪開腦實質表面軟腦膜，減掉周圍的顱神經及結締組織，進而剝離出整個腦。將剝離出的腦沿大腦縱裂切開，分成左、右半球，隨機取一側大腦半球迅速進行液氮冷凍保存，后儲存在-80 ℃冰箱中，以進行后期的SOD活力和MDA水平檢測，另一側大腦半球置入之前配制好的混合固定液(2%多聚甲醛+2.5%戊二醛)中進行標本固定。

1.3.3 大腦組織勻漿SOD活力和MDA水平檢測：將新鮮大腦半球組織以1∶10(m/V)加入RIPA裂解液，用機械研磨與超聲破碎儀打碎組織，制備10%的組織勻漿，高速離心后取上清液，檢測SOD活力和MDA水平。

1.3.4 大腦白質及其超微結構體視學研究

1.3.4.1 計算AD小鼠大腦半球白質總體積：隨機選擇沿冠狀面的子代鼠腦切片數個，將等距點陣圖與切片隨機疊加，在解剖顯微鏡下計數所有與白質重疊的點∑PWM，計算白質總體積VWM。VWM=t×a(p)×∑PWM，其中t為連續切片厚度，a(p)為與每個網格點相關的面積。

1.3.4.2 獲取電鏡照片：從選定腦切片上獲得包含腦白質的組織塊，進行電鏡包埋，使用透射電鏡觀察電鏡切片，每張切片上系統抽取5個8000倍及10個15000倍的視野。

1.3.4.3 計算白質中有髓纖維的長度密度和總長度：將無偏計數框與8000倍電鏡照片隨機疊加，計算白質中有髓纖維的長度密度LV(mf/wm) 和總長度L(mf，wm)。LV(mf/wm)=2×∑Q(mf)/[a(frame)×∑frame]，L(mf，wm)=LV(mf/wm)×VWM，其中∑Q(mf)是通過無偏計數框計數得出的電鏡照片中有髓纖維的總個數，a(frame)為單個無偏計數框的面積，∑frame為計數框的總個數。

1.3.4.4 計算白質中有髓纖維及髓鞘的體積密度和總體積：將等距點陣圖與8000倍電鏡照片隨機疊加，計數所有落在白質點數∑P(wm)、落在有髓纖維點數∑P(mf)及落在髓鞘點數∑P(ms)，計算有髓纖維的體積密度VV(mf/wm)、髓鞘的體積密度VV(ms/wm)、有髓纖維的總體積V(mf，wm)及髓鞘的總體積V(ms，wm)。Vv(mf/wm)=∑P(mf)/∑P(wm)，Vv(ms/wm)=∑P(ms)/∑P(wm)，V(mf，wm)=Vv(mf/wm)×VWM，V(ms，wm)=Vv(ms/wm)×VWM。

1.3.4.5 計算有髓纖維內直徑與外直徑：將無偏計數框與15000倍電鏡照片隨機疊加，確定落在無偏計數框內的神經纖維斷面。通過測量垂直于有髓纖維最長軸的最長輪廓直徑來估算有髓纖維的外直徑，通過測量垂直于軸突最長軸的最長輪廓直徑來估算有髓纖維的內直徑，測量內、外直徑，計算內、外直徑比值和差值。

1.3.4.6 計算有髓纖維內周長及外周長：將無偏計數框及等距平行線與15000倍電鏡照片隨機疊加，確定落在無偏計數框內的神經纖維斷面，計算斷面內有髓纖維的內周長或外周長b(ms)。b(ms)=π/2×d×∑I，其中d為等距平行線間的垂直距離，∑I為等距平行線與落在無偏計數框內的髓鞘內緣界線或外緣界線交叉的總點數，進而計算內、外周長比值和差值。

2 結 果

2.1 四組小鼠不同時間點體重比較 見表1。選取實驗第8、24、31天小鼠體重進行統計學分析，結果顯示四組小鼠體重比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表1 四組小鼠不同時間點體重比較(g)

2.2 四組小鼠SOD活力與MDA水平比較 見表2。M組SOD活力低于S組，PM組SOD活力高于M組(均P<0.05)。M組MDA水平高于S組，PM組MDA水平低于M組(均P<0.05)。

表2 四組小鼠SOD活力與MDA水平比較

2.3 四組小鼠大腦白質總體積、有髓神經纖維總長度、有髓神經纖維總體積、髓鞘總體積比較 見圖1。M組小鼠腦白質總體積、有髓神經纖維總長度、有髓神經纖維總體積、髓鞘總體積低于S組，PM組小鼠腦白質總體積、有髓神經纖維總長度、有髓神經纖維總體積、髓鞘總體積高于M組(均P<0.05)。

圖1 四組小鼠腦白質總體積(A)、有髓神經纖維總長度(B)、有髓神經纖維總體積(C)、髓鞘總體積(D)比較注：與M組比較，*P<0.05

2.4 四組小鼠大腦半球白質內有髓神經纖維髓鞘體視學分析 見表3。M組小鼠髓鞘內直徑及外直徑低于S組，PM組小鼠髓鞘內直徑及外直徑高于M組(均P<0.05)。

表3 四組小鼠大腦半球白質內有髓神經纖維髓鞘體視學分析結果

2.5 腦白質總體積、有髓神經纖維總長度、有髓神經纖維總體積、髓鞘總體積與腦組織勻漿中SOD活力及MDA水平相關性分析 一側腦白質總體積、有髓神經纖維總長度、有髓神經纖維總體積、髓鞘總體積與腦組織勻漿中SOD活力呈正相關，而與MDA水平呈負相關(r=0.522、0.522、0.501、0.466、-0.608、-0.613、-0.482、-0.661，均P<0.05)。

3 討 論

WM占人類總腦容量約50%，對于跨越不同腦區的電信號傳輸至關重要，因此WM損傷可導致嚴重的神經行為和認知障礙[17]。Nasrabady等[18]使用磁共振成像研究表明，WM高信號可預測AD發病率及AD患者認知能力下降的速度，并與AD遺傳危險因素相關。WM主要由成束的髓鞘或無髓鞘的軸突和產生髓磷脂的神經膠質細胞組成[19]，WM中的髓鞘軸突是皮質和皮質下區域之間有效神經傳遞的結構基礎[17]，WM損傷在組織病理學上與髓磷脂蒼白、髓磷脂丟失和髓鞘軸突丟失有關[20]。本研究發現AD模型小鼠腦白質總體積、有髓神經纖維和髓鞘的總體積以及有髓神經纖維總長度均顯著減少，與既往研究[17]一致，說明白質及其超微結構損害可能是AD患者學習和記憶能力受損的病理基礎。

在AD的背景下生物分子的氧化主要與神經元膜生物分子和膜完整性的破壞有關，涉及脂質(包括膽固醇)、蛋白質和核酸的氧化，以及由于其氧化導致的低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)對β-淀粉樣蛋白清除的損害[21]。腦WM的特征在于髓鞘的存在，而髓鞘由約70%脂質和約30%蛋白質組成[17]。傳統模型表明，白質中固有的抗氧化性能可能相對較低[22-23]，而富含脂質和蛋白質的髓鞘可以為過氧化反應提供豐富的底物而導致大量ROS的產生。本研究對髓鞘的分析發現，其內直徑及外直徑明顯降低，其殘存量與抗氧化能力呈正相關，而與過氧化水平呈負相關，因此推測AD小鼠中髓鞘脂質和蛋白質的過氧化會導致其結構或功能改變，影響WM在腦區信號傳遞中的作用，進而導致認知和行為障礙，而SOD融合蛋白可通過降低髓鞘脂質和蛋白質過氧化水平來保護WM功能免受損害，從而改善AD小鼠認知和記憶能力。有髓神經纖維髓鞘主要由少突膠質細胞構成，有研究[24-25]發現氧化應激誘導少突膠質細胞和少突膠質細胞前體細胞死亡，或抑制少突膠質細胞祖細胞的分化，即其破壞少突膠質細胞的成熟，因此氧化應激可能通過破壞髓鞘結構影響WM的傳導功能，進而導致學習和記憶功能障礙。而SOD融合蛋白可通過減輕氧化應激維持少突膠質細胞功能，從而維持髓鞘完整，減少學習和記憶能力損傷。

研究[11]發現，AD等病理狀態下產生的大量ROS可以快速活化小膠質細胞，而處于活化狀態的小膠質細胞可以產生多種神經毒性因子參與與神經退行性變相關的炎癥反應過程。產生的神經毒性因子包括促炎細胞因子和趨化因子等，它們通過激活RAGE信號轉導促進 環氧化酶(COX)-2表達和血小板活化。COX-2可以通過形成不同類型的自由基來增強炎癥反應，引起磷脂過氧化。血小板活化可通過增加谷氨酸鹽的釋放以及耦合突觸后N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體活化，增加一氧化氮的產生和隨后的線粒體去極化。這些事件共同促進了ROS的下游產生，導致WM損傷并進一步加重了認知功能障礙。另一方面，小膠質細胞參與神經發生，其炎性激活或產生神經毒性因子和細胞因子而破壞神經發生過程。活化小膠質細胞的毒性炎癥潛能可能延伸至少突膠質細胞，從而導致WM微觀結構改變，最終引起行為學改變。例如，腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種主要的促炎細胞因子，通過少突膠質細胞祖細胞表達的TNF受體發揮作用，并能抑制少突膠質細胞祖細胞的存活和分化，而干擾素(IFN)-γ則通過促進少突膠質細胞的代謝紊亂甚至細胞死亡來對中樞神經系統髓磷脂產生有害作用，隨后降低髓磷脂蛋白基因的表達，從而降低少突膠質細胞的髓鞘或髓鞘再生潛能。這些事件通過損傷少突膠質細胞而導致WM微觀結構受損，并導致AD小鼠行為障礙。這與本研究中AD小鼠WM損傷的結果一致，而抗氧化劑SOD融合蛋白可以通過清除ROS逆轉上述過程。

綜上所述，SOD融合蛋白腹腔干預可以減輕Aβ1-42誘導的AD小鼠腦內氧化應激水平以及腦白質及其超微結構變化。AD小鼠腦內氧化應激可能是白質受損的病理基礎。