基于氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)探討中風(fēng)康復(fù)膏對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用

汪湛東 毛忠南 張 娜 吳 琳 劉婭楠 陶成斌 張延英 宋 冰 徐曉艷* 王 鋼*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020

缺血性腦血管疾病是一種常見(jiàn)病，因其較高的發(fā)病率、致殘率和死亡率給患者及患者家庭和社會(huì)均造成了嚴(yán)重的影響，且發(fā)病年齡出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)是指腦部出現(xiàn)一段時(shí)間的缺血后恢復(fù)血供，腦部功能不僅未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，反而出現(xiàn)嚴(yán)重障礙的一種現(xiàn)象，也是該病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵組成部分[2]。

中風(fēng)康復(fù)膏(paste of stroke recovery, PSR)是甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科毛忠南主任醫(yī)師的治療驗(yàn)方，在十幾年的臨床診療中對(duì)于證屬肝腎虧虛、氣虛血瘀、痰濁阻滯腦竅所致的腦卒中(出血性、缺血性) 恢復(fù)期進(jìn)行干預(yù)，效果較為顯著[3-4]。研究通過(guò)建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，從抗炎、抗氧化應(yīng)激兩個(gè)角度研究中風(fēng)康復(fù)膏對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只，SPF級(jí)，體質(zhì)量220～280 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002，使用許可證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005。

1.2 藥物與試劑 中風(fēng)康復(fù)膏藥物組成：黃精 25 g,黃芪40 g,當(dāng)歸60 g,制何首烏30 g,熟地黃20 g,生地黃20 g,豨薟草(酒制)15 g,雞血藤20 g,枸杞子30 g,黨參20 g,白術(shù)20 g,吳茱萸25 g,陳皮20 g,佛手20 g。所有藥材加10倍量水浸泡12 h，應(yīng)用多功能提取罐提取，按高壓法煎煮2次，1煎150 min,2煎120 min,合并濾液加輔料濃縮，濃縮至每毫升藥液中含生藥7 g(即藥液質(zhì)量濃度為7 g/mL)，經(jīng)高溫滅菌，在室溫下冷卻，放入冰箱中 4 ℃ 冷藏備用。

實(shí)驗(yàn)中使用丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)A003-1-1)、一氧化氮合酶(NOS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)A014-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)H052-1)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)H002)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)JCL1238)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)JCL1243)，均購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司；TTC染色液(批號(hào)G3003)購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司，MCAO栓線(型號(hào)2363-A5，250～280 g)，購(gòu)自北京西濃科技有限公司。

1.3 儀器 3K15型低溫高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司)；721/721-100型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 造模 采用改良的Zea-longa等[2]的線栓法制備SD大鼠大腦中動(dòng)脈缺血-再灌注模型。栓線采用MCAO魚(yú)線，長(zhǎng)4.5 cm，直徑0.24 mm，一頭頂端為半球形，距頭端18～20 mm處有一黑色標(biāo)記。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，以7%水合氯醛(7 mL/kg體重)腹腔注射麻醉后，將大鼠頭部及四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，按外科常規(guī)手術(shù)用碘伏進(jìn)行消毒，鋪無(wú)菌巾，取頸部正中縱向切口，切口長(zhǎng)約2 cm，鈍性分離皮下組織，使用撐開(kāi)器充分暴露術(shù)區(qū)視野，解剖、游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA)，避免刺激迷走神經(jīng)。充分暴露右側(cè)ECA約3～5 mm后，用動(dòng)脈夾夾閉CCA近心端和ICA遠(yuǎn)心端,在ECA下放置兩根3-0手術(shù)絲線，于距離CCA分叉≥3 mm處雙結(jié)扎，用眼科手術(shù)剪在兩個(gè)線結(jié)中間偏遠(yuǎn)心端離斷ECA，并在ECA殘端剪一“V”形切口，將MCAO栓線由ECA緩慢插入ICA,打開(kāi)ICA遠(yuǎn)心端動(dòng)脈夾,緩慢將魚(yú)線推送入ICA至大腦中動(dòng)脈，根據(jù)魚(yú)線上的黑色標(biāo)記，推送約18～20 mm，感到有阻力時(shí)停止向前推進(jìn)魚(yú)線，將魚(yú)線與ECA殘端一起結(jié)扎；逐層縫合并將長(zhǎng)約 0.5 cm 魚(yú)線遠(yuǎn)端曠置、固定。將實(shí)驗(yàn)鼠置于單籠飼養(yǎng)，90 min后外拉魚(yú)線使其球端回至ECA，進(jìn)行缺血后再灌注。凡出現(xiàn)動(dòng)物術(shù)中死亡、蛛網(wǎng)膜下腔出血或無(wú)梗死灶均為MCAO模型制作失敗，并以相同操作方式隨機(jī)補(bǔ)充同批次備用大鼠。對(duì)假手術(shù)組手術(shù)時(shí)僅作頸部手術(shù)切口，手術(shù)分離暴露右側(cè)的頸總(CCA)、頸外(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，僅離斷頸外動(dòng)脈及其分支，不做插管。

1.4.2 分組與給藥 將50只體質(zhì)量220～280 g大鼠飼養(yǎng)于18～22 ℃，明暗各12 h的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自由進(jìn)食飲水喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中風(fēng)康復(fù)膏高劑量組(PSR-H組)、中風(fēng)康復(fù)膏中劑量組(PSR-M組)、中風(fēng)康復(fù)膏低劑量組(PSR-L組)，共5組。對(duì)各組大鼠于術(shù)前 (1次/12 h，3 d)及術(shù)后(1次/6 h，3 d)灌胃給藥，中風(fēng)康復(fù)膏高、中、低各劑量組按成人與大鼠體表面積比分別給予藥液(質(zhì)量濃度為 7 g/mL)：8.75 mL/kg、17.5 mL/kg、35 mL/kg灌胃；對(duì)假手術(shù)組和模型組給予 4 mL 生理鹽水灌胃。

1.4.3 神經(jīng)功能評(píng)分 采用Zea-Longa’s標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[5]判斷各組大鼠的神經(jīng)功能情況。0分為活動(dòng)正常，無(wú)任何神經(jīng)功能缺損癥狀；1分為提尾時(shí)見(jiàn)左側(cè)前爪不能充分伸展；2分為提尾時(shí)見(jiàn)左側(cè)前爪不能充分伸展，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為大鼠行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或傾斜；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.4.4 腦含水量 測(cè)定將各組大鼠麻醉后斷頭、取全腦， 去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織，即為腦濕重，110 ℃恒溫烘烤48 h后稱重即為腦干重；根據(jù)公式計(jì)算腦含水量：腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.4.5 TTC染色 將全腦置于0.9%氯化鈉溶液中洗滌，并在-20 ℃環(huán)境下速凍30 min固定腦組織，從大鼠腦組織冠狀面將大腦切成7片，每片厚約 1 mm，將切片放入1%的TTC染色液中，37 ℃避光染色，每15 min輕震蕩數(shù)次后取出，用4%多聚甲醛固定并拍照，正常區(qū)域?yàn)榧t色，缺血梗死區(qū)域?yàn)榘咨?。將照片?dǎo)入Image J軟件計(jì)算腦梗死體積占比，體積=厚度×面積。計(jì)算公式為：腦梗死體積占比=(梗死區(qū)域體積/整個(gè)腦的體積)×100%。

1.4.6 腦組織炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 斷頭處死各組大鼠，快速取腦，分離缺血側(cè)腦組織，放于低溫生理鹽水中冰浴，然后用刀片定量切取該側(cè)部分腦組織，濾紙吸干血跡，立即凍存于超低溫冰箱(-80 ℃)中。于檢測(cè)前制備10%腦組織勻漿并稱重，用眼科手術(shù)剪將其剪碎，按照1∶9的比例盡快加入預(yù)冷生理鹽水，放入高通量組織研磨器研磨1 min，制成腦組織勻漿，放入高速冷凍離心機(jī)，4 ℃，3500 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定大鼠缺血側(cè)腦組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)、脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)指標(biāo)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量及神經(jīng)功能評(píng)分比較 采用稱重法檢測(cè)大鼠腦含水量變化，并采用Zea-Longa’s標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，與假手術(shù)組相比，模型組的腦含水量及神經(jīng)功能評(píng)分均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，PSR-H組和PSR-M組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分及腦含水量顯著降低(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量及神經(jīng)功能評(píng)分比較

表1 各組大鼠腦組織含水量及神經(jīng)功能評(píng)分比較

組別動(dòng)物數(shù)/只腦含水量/%Zea-Longas評(píng)分假手術(shù)組1011.3±2.10.4±0.1模型組1043.1±7.0??2.5±0.3??PSR-L組1034.6±3.62.3±0.8PSR-M組1031.1±4.1△△2.2±0.5△△PSR-H組1026.3±2.8△△2.1±0.1△△

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01。

2.2 腦缺血再灌注TTC染色結(jié)果 采用 TCC 染色法檢測(cè)各組大鼠腦梗死情況，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織切片存在明顯白色梗死區(qū)，梗死體積百分比顯著升高(P<0.01) 。而PSR給藥干預(yù)后，相對(duì)于模型組大鼠，腦組織梗死體積百分比均有所降低，其中PSR-H組大鼠腦組織梗死體積百分比減少最為顯著(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。各組大鼠腦組織TTC染色切片如圖1所示。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較

表2 各組大鼠腦梗死體積比較

組別腦梗死體積百分比/%假手術(shù)組0.0±0.0模型組22.1±2.6??PSR-L組20.3±3.2PSR-M組14.1±1.9△△PSR-H組10.5±2.3△△

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色切片圖

2.3 腦組織炎癥因子表達(dá)情況 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1的含量均顯著升高(P<0.01)。而PSR給藥干預(yù)后，相對(duì)于模型組大鼠，其炎癥因子表達(dá)量均有所下降，其中PSR-H組大鼠腦組織的炎癥因子表達(dá)量下降最為顯著(P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子表達(dá)情況

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子表達(dá)情況

分組TNF-α/nmoL·L-1lL-1β/nmoL·L-1ICAM-1/pg·mL-1VCAM-1/pg·mL-1假手術(shù)組27.2±8.9418.5±37.7129.1±12.423.4±4.0模型組71.8±12.1??878.7±125.2??315.6±39.8??57.8±12.4??PSR-L組60.2±9.8747.0±71.4238.3±31.345.6±6.8PSR-M組52.9±8.7△△596.3±94.9△△235.5±13.2△△37.3±4.1△△PSR-H組47.7±11.6△△501.9±95.3△△179.4±13.5△△30.1±3.6△△

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

2.4 腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量和NOS活力明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，PSR給藥組MDA含量和NOS活力均有所下降，其中PSR-H組、PSR-M組大鼠腦組織中MDA含量和NOS活力下降較為明顯(P<0.01) 。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)情況

表4 各組大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)情況

組別MDA/μmol/g protNOS/U/mg prot假手術(shù)組2.6±0.60.5±0.1模型組6.8±1.7??0.9±0.2??PSR-L組4.4±3.50.6±0.1PSR-M組4.4±1.9△△0.5±0.4△△PSR-H組3.8±1.6△△0.5±0.1△△

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

3 討論

臨床研究認(rèn)為，由于腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的中風(fēng)患者多是在氣血內(nèi)虛的根本上，加之勞倦內(nèi)傷、憂思惱怒、吸煙喝酒等誘因，引起氣血瘀滯，腦脈痹阻[6]。本病的關(guān)鍵機(jī)制是氣滯、血瘀、絡(luò)阻，“氣行則血行”，常以行氣、活血、通絡(luò)的方法進(jìn)行診療[7]。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院毛忠南主任醫(yī)師在治療中風(fēng)疾病上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，PSR在康復(fù)醫(yī)學(xué)科已應(yīng)用多年，對(duì)于中風(fēng)恢復(fù)期、出血性腦中風(fēng)恢復(fù)期、缺血性腦中風(fēng)恢復(fù)期，臨床觀察療效明顯[3-4]。

中風(fēng)康復(fù)膏中黃精補(bǔ)中益氣、滋腎益肺，制何首烏、枸杞子補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血，生地黃、熟地黃補(bǔ)血生津、益精補(bǔ)腎，豨薟草強(qiáng)健筋骨，黃芪、黨參、雞血藤、岷當(dāng)歸補(bǔ)益氣血、活血通絡(luò)，吳茱萸、佛手、陳皮調(diào)理氣機(jī)、化痰祛濕，白術(shù)補(bǔ)氣健脾。諸藥配伍，共奏補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血、活血化痰之功，可使氣血通暢，精氣充足，從而腦髓得充，痰瘀自消，靈竅得養(yǎng)。研究[8]表明，中風(fēng)康復(fù)膏可增強(qiáng)腦組織對(duì)缺血、缺氧的耐受性，能明顯減輕ICS患者認(rèn)知功能的損害程度，改善患者的日常生活能力，提高患者的生活質(zhì)量，降低患者病死率和致殘率。

神經(jīng)功能評(píng)分常被用作藥物研究中的一項(xiàng)重要指標(biāo)，已成為評(píng)價(jià)藥效的重要依據(jù)[9]。本研究采用Zea-Longa’s標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分評(píng)價(jià)PSR對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的改善效果。結(jié)果顯示，PSR干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，表明PSR能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能損傷。腦水腫是CIRI的主要并發(fā)癥之一，能夠引起顱內(nèi)壓增高，加重機(jī)械性壓迫，損害腦微循環(huán)和細(xì)胞能量代謝，從而加重腦損害[10]。通過(guò)檢測(cè)腦含水量能夠有效反映腦缺血再灌注的損傷程度。腦梗死的病灶范圍是對(duì)腦缺血再灌注損傷中腦組織損傷程度最直觀的反映，TTC染色后腦梗死體現(xiàn)為明顯白色區(qū)域。研究結(jié)果表明，模型組大鼠較假手術(shù)組腦含水量明顯升高，梗死范圍縮小，不同濃度的PSR干預(yù)下，大鼠的腦含水量和腦梗死面積得到不同程度的降低，明顯改善了腦組織缺血再灌注損傷的恢復(fù)水平，對(duì)腦組織損傷的大鼠具有保護(hù)作用。

研究[11-13]表明，炎癥反應(yīng)是與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)的病理途徑，發(fā)揮著關(guān)鍵作用，腦缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，通過(guò)釋放TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1等炎癥因子增大血腦屏障通透性，導(dǎo)致腦組織的水腫更加嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥因子更容易透過(guò)血腦屏障，最終加重炎癥反應(yīng)[14]。TNF-α、IL-1β是重要的炎癥因子，在腦缺血中發(fā)揮著重要的作用[15]。同時(shí)VCAM-1和ICAM-1在炎癥和腫瘤等病理過(guò)程中扮演著重要的角色[16]。研究顯示，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)量明顯升高，表明模型組大鼠由于CIRI產(chǎn)生明顯炎癥反應(yīng)；PSR干預(yù)后，大鼠炎癥因子表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明PSR可以有效的抑制CIRI炎癥反應(yīng)。

臨床上發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中病人恢復(fù)血流供應(yīng)后，腦損傷反而加重，即缺血再灌注損傷，氧化應(yīng)激過(guò)程是其不可忽視重要環(huán)節(jié)，降低氧化應(yīng)激損傷，可能對(duì)腦缺血再灌注損傷的減輕以及下游病理生理反應(yīng)起到關(guān)鍵作用[17]，氧化應(yīng)激發(fā)生后產(chǎn)生大量活性氧發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，其終產(chǎn)物為MDA，同時(shí)MDA可影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物和線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，因此MDA可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞氧化損傷程度[18]。在腦缺血再灌注進(jìn)程中NO可以和超氧陰離子反應(yīng)形成強(qiáng)氧化劑，使蛋白質(zhì)硝基化并損傷DNA，而NOS可催化NO生成，因此許多研究中采用NOS活力反映NO含量[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，PSR給藥組MDA含量和NOS活力均有所下降，其中尤其以PSR中、高劑量組大鼠腦組織中MDA含量和NOS活力下降較為明顯。

綜上所述，研究結(jié)果證實(shí)，中風(fēng)康復(fù)膏能夠改善MCAO模型大鼠的腦缺血再灌注損傷，相關(guān)機(jī)制可能與抑制炎癥因子釋放、減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究只是初步探討了中風(fēng)康復(fù)膏對(duì)MCAO模型大鼠的保護(hù)作用，其具體分子作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。