刺梨鮮果質量標準提升研究

祝清燦 石 亞 孫宜春 段 麗 王 杏 劉 凱 李慧馨 豐 敏

國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550026

刺梨，又名送春花、茨梨、木梨子、梨石榴，為薔薇科植物單瓣繅絲花RosaroxburghiiTratt．f.normalis Rehd.et Wils.及繅絲花RosaroxburghiiTratt.的果實，味酸甜、澀，8～10月采收，鮮用，為《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[1]收錄的貴州省少數民族用藥，廣泛分于貴州、云南、四川、陜西、甘肅、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、西藏等省區，是貴州特色水果資源。具有消食健脾，收斂止瀉的功效，臨床主要用于積食腹脹、泄瀉等。現代研究[2]表明，刺梨果肉中含大量的維生素、有機酸、超氧化物歧化酶(SOD)、刺梨黃酮、刺梨多糖、氨基酸、微量元素等成分，尤以維生素C的含量最為豐富，被譽為“維C之王”，具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、抗應激、調節消化系統、降低重金屬負荷等藥理作用[3-6]。現行標準項下僅收載性狀、理化鑒別項目，鑒別方法專屬性不強。貴州省藥品監督管理局將刺梨納入《貴州省中藥材、民族藥材質量標準研究》計劃，筆者建立了薄層色譜鑒別方法，采用高效液相色譜法測定鮮刺梨果中維生素C含量，為質量標準修訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Vanquish型超高效液相色譜儀 (賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀[ 安捷倫科技(中國)有限公司]；色譜柱：PntulipsTM BP-NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Welch Ultimate Hilic-NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；菲羅門 ACE Excel NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Goodsee-II型紫外分析儀(上海科哲生化科技有限公司)；202-0型電熱鼓風干燥箱(上海路達實驗儀器有限公司)；ME204TE/02型電子天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]；SB25-12DTS型數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥 刺梨對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121356-200401)；維生素C對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：C100425-201504)；乙腈(美國天地，批號：19035082)；甲醇[重慶江川化工(集團)有限公司，批號：21070908]；乙醇[重慶川東化工(集團)有限公司，批號：20170901]；鹽酸[重慶川東化工(集團)有限公司，批號：20200401]；乙酸乙酯(成都市科龍化工試劑廠，批號：2017050201)；醋酸[重慶川東化工(集團)有限公司，批號：20190701]；二水合草酸(成都金山化工試劑廠，批號：20170312)；磷酸[重慶川東化工(集團)有限公司，批號：20190601]；化學試劑均為分析純；水為自制純化水。

1.3 材料 自制硅膠G薄層板(批號：20171108)；硅膠G薄層板(青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號：20140820)；硅膠G預制板(德國默克公司，批號：1.05626.0001；國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170912)；硅膠G薄層板(批號：20170720)、硅膠G高效板(批號：20170831)、硅膠H板(批號：20160715)、硅膠GF254板(批號：20140910)均購自青島海洋化工有限公司。樣品由國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司種植部提供，經貴州中醫藥大學藥學院何順志教授鑒定為薔薇科植物單瓣繅絲花RosaroxburghiiTratt．f.normalis Rehd.et Wils.及繅絲花RosaroxburghiiTratt.的果實。憑證標本存放于國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司。樣品來源見表1。

表1 樣品來源

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別 將鮮刺梨果搗碎，取果肉漿約10 g，加水20 mL，超聲處理20 min，過濾，取濾液，用鹽酸飽和的乙醚萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取刺梨果對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2020年版四部通則(0502)試驗[7]，吸取上述兩種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，揮干，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。置日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖1所示。

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2.2 維生素C含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適應性試驗 以氨基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇∶0.1%偏磷酸溶液(10∶90)為流動相；檢測波長為243 nm；流速為 1 mL·min-1；柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。理論板數按維生素C峰計算不低于5000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取維生素C對照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加0.5%亞硫酸氫鈉(用磷酸調節pH值至 2.4)溶解并稀釋至刻度 ，制成1 mL含有100 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 將鮮刺梨果搗碎，取果肉漿約4 g，精密稱定，置于250 mL的棕色容量瓶中，加入0.5%亞硫酸氫鈉溶液(磷酸調節pH值至2.4)至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用0.5%亞硫酸氫鈉溶液補足損失的重量，搖勻，取上清液，濾過，取續濾液，作為供試品溶液[8]。

2.2.4 空白對照溶液制備 取0.5%亞硫酸氫鈉溶液作為空白對照溶液。

2.2.5 專屬性 分別取“2.2.2、2.2.3、2.2.4”項下對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果表明，分離度符合要求，陰性樣品無干擾，如圖2所示。

A.維生素C對照品；B.供試品；C.空白對照溶液

采用二級管陣列檢測器對供試品溶液中的維生素C色譜峰進行峰光譜掃描和純度檢測，結果顯示，峰純度角度<峰純度閾值，供試品中維生素C光譜圖與譜庫中維生素C光譜圖匹配理想，說明維生素C峰為純峰，專屬性符合要求。

2.2.6 線性關系考察 精密稱取維生素C對照品適量，置10 mL棕色容量瓶中，加0.5%的亞硫酸氫鈉(用磷酸調節pH值至2.4)溶液溶解并稀釋到刻度，即得(每1 mL含維生素C 3.303 mg)，作為儲備液。分別精密吸取該儲備液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，置于10 mL的棕色容量瓶中，用0.5%的亞硫酸氫鈉(磷酸調節pH為2.4)溶液定容，制成系列濃度對照品溶液I～Ⅵ(濃度分別為：0.06606 mg·mL-1、0.13212 mg·mL-1、0.19818 mg·mL-1、0.26424 mg·mL-1、0.33030 mg·mL-1、0.39636 mg·mL-1)，分別精密吸取系列濃度對照品溶液I～Ⅵ各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”色譜條件測定各自峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，求得維生素C的線性回歸方程為：Y=32.656X+135.61，R2=0.9998，結果表明：維生素C進樣量在0.6606～3.9636 μg的范圍內與峰面積值呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取維生素C對照品溶液(每1 mL含維生素C 0.9818 mg)10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積，計算6次維生素C峰面積的RSD值。結果，維生素C峰面積的RSD值為1.0%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 將鮮刺梨果(批號：200901)搗碎，混勻，取6份，每份約4 g，精密稱定，按正文供試品溶液制備方法及色譜條件測定，計算6份樣品中維生素C峰面積的RSD值。結果，6次維生素C峰面積的RSD=2.3%，表明該方法的重復性良好。

2.2.9 穩定性試驗 取“2.2.8 重復性試驗”制備的供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 測定維生素C的峰面積，計算維生素C峰面積的RSD值。結果表明，維生素C的RSD 為0.21%，表明維生素C在24 h內基本穩定。

2.2.10 耐用性考察 將鮮刺梨果(批號：200901)搗碎，混勻，取約4 g， 按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，采用3種品牌的色譜柱測定維生素C的含量，色譜柱：PntulipsTM BP-NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Welch Ultimate Hilic-NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；菲羅門 ACE Excel NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結果顯示，色譜峰分離均良好，含量測定結果無顯著差異，RSD=2.6%，表明測定方法的耐用性較好。

2.2.11 加樣回收試驗 取已知含量的鮮刺梨藥材(批號：200901，含量為5.72 mg·g-1)搗碎，混勻，取9份，每份約0.2 g，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，按已知含有量的80%、100%、120%水平加入對照品溶液(每1 mL含維生素C 0.9818 mg)，1～3號樣品每份分別精密加入對照品溶液 0.8 mL；4～6號樣品每份分別精密加入對照品溶液1.0 mL；7～9號樣品每份分別精密加入對照品溶液1.2 mL；按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算維生素C回收率，維生素C平均回收率為98.37%，12次測回收率的RSD=2.0%，表明方法的準確度較好。結果見表2。

表2 維生素C的回收率試驗結果

2.2.12 樣品含量測定 取鮮刺梨藥材12批，按“2.2.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定維生素C含量，結果見表3。

表3 維生素C測定結果

根據測定結果，12批鮮刺梨藥材含量范圍為5.16～10.22 mg·g-1，平均值為7.22 mg·g-1，以平均值的80%設限時，為5.78 mg·g-1，考慮到各種藥材原料含量的波動，故建議將鮮刺梨中維生素C含量限度標準暫定為不得少于 5.50 mg·g-1。

3 討論

3.1 薄層色譜法供試品溶液制備 根據化學成分的溶解性，分別對提取溶劑(甲醇、乙醇、水)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(10 mL、20 mL、30 mL)，萃取溶劑(乙醚、乙酸乙酯)，萃取劑用量(10 mL、20 mL、30 mL)等條件進行考察，結果表明，以文章中制備方法制備的供試品溶液鑒別斑點最清晰。

3.2 薄層色譜條件考察 根據展開樣品主要化學成分的極性，對展開系統如石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-甲醇(5∶6∶1)，正己烷-乙酸乙酯-甲醇(5∶4∶1)，硅膠板種類(硅膠G板、硅膠H板，硅膠GF254板)，樣品點樣量(3 μL、5 μL、7 μL、10 μL)，點樣條帶寬度(5 mm、6 mm、7 mm、8 mm)，薄層板預平衡時間(10 min、20 min、30 min)，展開溫度(10 ℃、20 ℃、30 ℃)等進行了考察。結果表明，使用文章中所用的色譜條件時，展開效果較好，供試品與對照品及對照藥材在不同的檢視條件下色譜條帶數較多，分離度較好。

3.3 高效液相色譜法供試品溶液制備 分別對提取溶劑[1.0%草酸溶液、0.001 moL·L-1鹽酸溶液、0.5%亞硫酸氫鈉溶液(用磷酸調節pH值至2.4)、0.5%醋酸溶液]，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(150 mL、200 mL、250 mL)，提取時間(10 min、20 min、30 min)等條件進行考察，結果表明，以文章中制備方法制備的供試品溶液峰面積最大。

3.4 高效液相色譜法色譜條件選擇 分別考察采用乙腈-0.01 moL·L-1磷酸氫二鉀(10∶90)，甲醇-0.01 moL·L-1磷酸氫二鉀(10∶90)，乙腈-0.1%偏磷酸(10∶90)及不同比例的甲醇-0.1%偏磷酸為流動相時的分離情況，結果表明：以甲醇-0.1%偏磷酸(10∶90)為流動相，各色譜峰的分離效果較好。采用二極管陣列檢測器對供試品溶液中維生素C在200 nm～450 nm范圍內進行全波長掃描，結果表明，維生素C在波長為 243 nm 處的峰純度較高，峰面積最大，由此確定檢測波長為243 nm。

綜上，鮮刺梨的薄層色譜鑒別方法專屬性強，陰性樣品無干擾，薄層色譜斑點清晰，分離度較好；維生素C含量測定方法的專屬性較強，準確度較高，穩定性、耐用性、重現性較好；可以為提高刺梨藥材的質量控制標準提供科學依據。