Hi-C技術：探究三維基因組迷宮

■文/田曉雪

H i-C 技術自2009年由美國馬薩諸塞大學醫學院教授喬布·德克爾（Job Dekker）研究團隊首次提出以來，發展得如火如荼。這把揭秘三維基因組的鑰匙將會在哪些方面助力科研、造福人類呢？

眾所周知，一顆受精卵經過不斷增殖、分化，可以生長發育為一個由種類高達200 余種、數目以萬億計的細胞組成的復雜機體。然而，共享一套遺傳系統的細胞是如何發育成為形態、功能各異的組織器官的呢？作為主要的遺傳物質，脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的展開長度可以達到2 米，這些DNA 是如何被放置在一個直徑只有10 微米左右的細胞核中的呢？在這種極度壓縮的環境下，它們又是如何精確調控細胞功能，維持機體穩態的呢？

長期以來，這些難題像一把“枷鎖”，嚴重阻礙了生命科學的發展進程。高通量染色質構象捕獲（High-throughput/resolution chromosome conformation capture，Hi-C）技術的出現，幫助我們深入探究基因組三維結構之謎，為基因研究提供了強大的推動力，是一把名副其實的基因鑰匙。

以我們自身為例，人類體細胞的核內存在著彼此獨立又相互聯系的46 條染色體，它們主要由遺傳物質DNA 和組蛋白組成。其中，DNA 一般以染色質絲的形式存在，染色質絲纏繞在組蛋白復合物上，形成串珠樣結構。串珠樣的染色質會進一步像電話線一樣纏繞折疊，形成極度壓縮而又高度有序的狀態，分布在細胞核的特定位置，稱為染色質疆域（Chromosome territories，CT）。簡單來講，染色質疆域指的是不同染色體占據的不同空間。一直以來，我們主要通過X 射線、顯微鏡等傳統方式觀察染色質和其折疊狀態。受限于分辨率低、通量小等因素，我們對其折疊的具體機制知之甚少。作為基因組密鑰，Hi-C 技術的出現為我們提供了新的視角。

Hi-C 技術的原理

Hi-C 技術源于染色體構象捕獲（Chromosome conformation capture，3C）技術，以整個細胞核為研究對象，利用高通量測序技術，結合生物信息分析方法，研究全基因組范圍內整個染色質DNA 在空間位置上的關系，通過對染色質內全部DNA 相互作用模式進行捕獲，獲得高分辨率的染色質三維結構。實驗流程并不復雜，主要包括細胞交聯（Crosslink）、酶切（Digestion）、環化連接（Ligation）、純化建庫（Purification and Library preparation）和測序分析（Sequencing）等步驟(見圖1)。

Hi-C 技術揭秘染色質空間結構

圖1 Hi-C 實驗流程

染色質疆域是我們對染色質空間結構認知的第一步，Hi-C 技術不僅可以高分辨地解析出傳統方法觀察不到的染色質疆域，而且能進一步幫助我們解析出染色質疆域內各種亞結構。如圖2 所示，按照基因組從大到小的順序排列，依次為A/B 染色質區室（A/B compartments）、域（domain）和染色質環（Chromatin loop，CL）。具體來講，放大染色質疆域的某一空間，我們可以根據染色質的活性將其分為A/B 區室。A 區染色質為活躍區，基因表達較為豐富，鳥嘌呤和胞嘧啶（GC）含量較高，通常高度轉錄，包含用于主動轉錄的組蛋白標記，位于細胞核的內部；B 區是關閉的染色質，結構緊湊，基因表達豐度和轉錄活性均較低，含有基因沉默的組蛋白標志物，位于核的外圍。在A/B 區室中，我們將比例尺進一步放大，可以發現互相作用相對頻繁的基因組區域，這些就是域，如拓撲相關結構域（Topologically associated domain，TAD） 等。TAD 是一個高度自關聯的連續區域，通過明顯的邊界與相鄰區域分離開來。TAD 邊界通常具有大量的絕緣子蛋白和黏連蛋白，對結構的維持及穩定性具有重要作用。TAD 是一個獨立的調控單元，在哺乳動物基因組中，TAD 通常由轉錄抑制因子CTCF 分割開來。CTCF 非常活躍，它可以和黏連蛋白復合物結合，把分布較遠的增強子（enhancer）和啟動子（promoter）等DNA 元件綁到一起，形成染色質環，作為染色質三維結構的基本結構。利用Hi-C 技術，我們可以從A/B 區室、TAD 和染色質環三個層次解析基因組的三維結構，更好地理解機體內正在發生的生理生化過程。

科學家利用Hi-C 技術以機體發育和衰老等生理過程為模型，增進了對染色質層級結構的發生機制及其與基因組功能關系的理解。其中，染色質環可以使空間上相隔較遠的DNA 調控元件，如啟動子和增強子等在物理維度上相互接近，從而調控基因轉錄、核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）剪接等重要的生化過程。TAD 作為更大、更保守的結構功能單元，通過限制、引導和促進增強子-啟動子的相互作用，從而協調基因調控。此外，科學家還發現：在機體發育早期，TAD 和A/B 區室等染色質高級結構存在著緩慢建立的過程；在配子發生、合子基因組激活及組織分化發育等一系列事件中，包括TAD、A/B 區室等在內的基因組三維結構會經歷劇烈且特異性的消失-重建過程。

圖2 基于3C 技術的三維基因組的層次結構

Hi-C 技術助力疾病研究

基因組三維結構異常與表觀遺傳修飾如DNA修飾、組蛋白修飾等密切相關，在疾病的發生、發展中發揮著重要作用。Hi-C 技術幫助我們深刻認識到，許多疾病的發生、發展與基因組三維結構的異常存在相關性。當基因組結構發生變異，如單核苷酸突變、小片段核酸序列（50 個堿基對以下）的異常插入或缺失（Insertion-deletion，InDel）和染色體結構變異均可導致疾病的發生、發展。例如，染色質環的重要組成部分黏連蛋白發生突變時，會引起基因組的結構異常，導致Cornelia de lange 綜合征（CdLS）等遺傳病的發生。WNT6/IHH/EPHA4/PAX3 等基因位點TAD 區域遭到破壞時，會引起異常的增強子-啟動子相互作用，從而使基因錯誤表達，導致先天性發育障礙。

基因組三維結構與病毒感染密切相關。科學家應用Hi-C 技術發現休眠狀態下的乙型肝炎病毒（HBV）主要寄宿在19 號染色體的異染色質附近區域，但當其活化后，則會更多地寄宿在基因組轉錄活躍區域。同樣的，對罕見的艾滋病自愈者進行Hi-C 數據分析發現，艾滋病病毒（HIV）主要存在于19 號染色體的中心粒衛星DNA 或KRAB-ZNF 基因位置，且多異染色體標記，與基因轉錄起始位置或開放染色質相距較遠。

另外，基因組三維結構在腫瘤發生、發展中也發揮著重要作用。絕緣子蛋白CTCF 的旁系同源蛋白CTCFL 在多種腫瘤中表達異常，可維持腫瘤干細胞的活性，提高腫瘤風險等級，而且嚴重影響腫瘤藥物的治療作用。Hi-C 技術與其他組學技術的聯合開發應用，為我們理解腫瘤的發生、發展提供了新的視角。科學家應用Hi-C 技術和多組學技術發現：相比正常細胞，乳腺癌細胞中約12%的基因組區域發生了A/B 區室的轉換；前列腺癌細胞比正常細胞具有更多的TAD 和更小的TAD 長度，并且在具有拷貝數變異的區域里發現了許多癌癥特異性的TAD 邊界；在轉移性胰腺癌細胞中，A/B 區室、TAD 和染色質環都發生了顯著變化；在多發性骨髓瘤中，拷貝數變異的斷點常與TAD 邊界重合；對脊索瘤進行Hi-C、RNA 高通量測序（RNA-seq）等多組學分析發現，碳酸酐酶2（Carbonic anhydrase II，CA2）在脊索瘤中高表達，可以作為新的治療靶點。由此可見，Hi-C 技術在疾病的診斷和治療方面發揮著獨特作用。

Hi-C 技術推動構建物種進化樹

此外，Hi-C 技術在基因組從頭拼接、物種進化樹構建方面也發揮了巨大作用。目前，高通量測序方法只能夠將基因組組裝到重疊群/腳手架（Contig/Scaffold）水平，無法獲得染色體水平的基因組信息。Hi-C 輔助組裝技術可將Contig/Scaffold 掛載到不同的染色體上，提升基因組質量。真核生物間Hi-C 圖譜的比較使我們對物種間差異有了進一步的認識，并有助于揭示物種進化和選擇的奧秘。

隨著Hi-C 衍生技術的開發應用，我們對細胞內的微觀世界有了更深入的了解和認識。然而，我們還應該認識到，Hi-C 技術依然存在諸多局限性：分辨率較低、與高分辨率顯微鏡結果擬合度較低、實驗門檻較高和數據分析難度較大等。但是，我們堅信，隨著技術的更新迭代和多種組學技術的聯合開發應用，我們將會慢慢揭開三維基因組的奧秘，助力疾病研究，為人類福祉作出貢獻。