柴苓舒肝丸藥物代謝動力學及毒理學的研究

張培會，湯 曉，朱玉蘋，杜希揚

（臨沂市中醫醫院，山東 臨沂 276002）

柴苓舒肝丸（備案號：魯藥制備字Z20210069000）為我院名老中醫經驗方，其由茯苓、柴胡、黨參、黃芪、薏苡仁、郁金、赤芍等19味中藥材制備而成的水丸，用于治療肝郁脾虛、濕毒內蘊之證。藥物代謝動力學是貫穿藥物發現、研究、開發和臨床應用全過程的重要學科[1]，研究藥物在體內吸收、分布、代謝和排泄的過程及其動態變化，并用動力學原理闡明動態變化規律[2]。毒理學是一門研究外源因素（化學、物理、生物因素）對生物系統的有害作用的應用學科，其中肝、脾、心、腦等臟器的絕對重量及臟器系數作為了解臟器生長發育以及病理損傷情況的指標被列為安全性毒理學評價的觀察指標[3]。本研究在對柴苓舒肝丸嚴格質控的基礎上[4]，充分借助于CUMS大鼠模型，對其藥動學特征和臟器毒性進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級Wistar大鼠60只，6～8周齡，體質量（200±20）g。

1.2 儀器

Acquity UPLC（ 美 國Waters公 司）；TSQ Endura MS（美國Thermo Fisher公司）；XS205電子天平（METTLER TOLEDO公司）；3K15型高速冷凍離心機（Sigma 公司）；Z326K型高速冷凍離心機（Hermle 公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DW-86W100醫用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）。

1.3 動物分組和干預方法

所有動物適應性飼養1周，隨機分為對照組、模型組、陽性藥組及中藥組，各組15只。對照組正常飼養，其余各組采用慢性溫和應激（CUMS）法制備大鼠抑郁模型，在此基礎上，陽性藥組及中藥組分別采用氟西汀和柴苓舒肝丸懸濁液（無菌蒸餾水配置）灌胃，給藥量為人體8倍量，持續灌胃6個月。

CUMS方法：使用7種不可預知的溫和性刺激（包括夾尾3 min、震蕩30 min、束縛2 h、夜間光照12 h、斷食24 h、斷水24 h 和潮濕墊料24 h）持續刺激21 d，平均每種刺激使用3次，每日的刺激不應在同一時間段進行，避免大鼠產生耐受性，影響實驗結果。實驗過程中注意保持室內整潔、安靜，溫度、濕度適宜，盡量減少空氣流動，實驗人員操作力度適當，避免影響實驗結果。

給藥方法：灌胃，氟西汀和柴苓舒肝丸均以無菌蒸餾水溶解，制備混懸液，給藥劑量為人體8倍量。每天早上8：00灌胃，每日1次，連續6個月。

1.4 藥物代謝動力學

1.4.1 試驗過程 給各組健康SPF級Wistar大鼠每天早上8：00灌胃，每日1次，連續6個月。第1天給藥前和給藥后 0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h鎖骨下頸靜脈采集血液，獲得單次給藥的血藥濃度數據；第4、5、6天給藥前和給藥后0.5 h采集血液，觀察穩態谷、峰濃度；第7天給藥前和給藥后 0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h采集血液，獲得多次給藥的血藥濃度數據。采集的血液4 000 rpm離心10 min，分離血漿后，用UPLC-MS/MS法測定血漿中柴胡皂苷D和黃芪甲苷的含量。

1.4.2 血漿樣品檢測前的預處理方法 50 μL含藥血漿樣品，加入5 μL內標工作液，100 μL甲醇沉淀液，渦旋，9 100 g離心10 min，取上清液100 μL，加入100 μL 80%甲醇水混勻，渦旋，9 100 g離心10 min后，取 120 μL 上清液進樣 5 μL。

1.5 毒理檢測

灌胃時間6個月，灌胃結束時處死剩余大鼠，解剖主要組織器官（心、肝、脾、肺、腎），精密稱量、計算臟器指數，同時HE 染色觀察各組織器官病理改變情況。

2 結果

2.1 藥物代謝動力學結果分析

2.1.1 個體動物的平均血藥濃度—時間數據 大鼠單次給藥前的血藥濃度均低于定量下限。灌胃給藥后，柴胡皂苷D和黃芪甲苷的血藥濃度在0.5 h最高。隨著時間增加，血藥濃度逐漸降低，24 h時均低于定量下限（見表1）。

表1 大鼠單次灌胃柴苓舒肝丸后的平均血藥濃度—時間數據 ng·mL-1

多次給藥期間的谷濃度和第7天給藥前的血藥濃度均低于定量下限，多次給藥期間的峰濃度與單次給藥一致；多次給藥后，血藥濃度趨勢沒有明顯的變化（見表2）。

表2 大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸水溶后的平均血藥濃度—時間數據 ng·mL-1

2.1.2 平均血藥濃度—時間曲線 大鼠單次灌胃給藥后，柴胡皂苷D和黃芪甲苷的血藥濃度均在0.5 h達峰，說明吸收快，隨后逐漸下降（見圖1）；由半對數曲線圖可見，柴胡皂苷D的消除速率比黃芪甲苷快（見圖2）。

圖1 大鼠單次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的平均血藥濃度—時間曲線

圖2 大鼠單次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的半對數平均血藥濃度—時間曲線

大鼠多次灌胃給藥后，柴胡皂苷D和黃芪甲苷在第4、5、6天的峰濃度與第1天和第7天接近，無明顯變化。柴胡皂苷D和黃芪甲苷在第1天和第7天給藥后的消除過程是一致的，柴胡皂苷D的消除速率比黃芪甲苷快（見圖3、圖4）。

圖3 大鼠多次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的平均血藥濃度-時間曲

圖4 大鼠多次灌胃柴芩舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的半對數平均血藥濃度-時間曲線

2.1.3 藥代參數計算

2.1.3.1 個體動物的平均藥代參數 大鼠單次和多次灌胃柴芩舒肝丸后，血漿中柴胡皂苷D的平均AUC（0-t）分別為 22.0 μg·L-1·h-1、22.9 μg·L-1·h-1，平均 Cmax分別為 15.9 μg·L-1、16.1 μg·L-1，t1/2分別為2.07 h、2.27 h，表觀分布容積Vd分別為124 L·kg-1、130 L·kg-1；血漿中黃芪甲苷的平均AUC（0-t）分別為49.3 μg·L-1·h-1、48.3 μg·L-1·h-1，平均 Cmax分別為13.5 μg·L-1、14.2 μg·L-1，t1/2分別為 4.04 h、3.61 h，表觀分布容積 Vd分別為 103 μg·L-1、94 L·kg-1（見表3、表4）。這些數據表明大鼠單次和多次灌胃柴芩舒肝丸后，柴胡皂苷D具有消除快、分布廣的特點，黃芪甲苷消除較慢、分布廣。

表3 大鼠單次灌胃柴苓舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的藥代動力學參數

表4 大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸后柴胡皂苷D和黃芪甲苷的藥代動力學參數

2.1.3.2 多次給藥后的藥代動力學參數變化 大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸后，柴胡皂苷D的AUC（0-t）和Cmax分別為單次注射的1.04、1.07倍，無明顯變化，說明連續給藥7 d大鼠血液中沒有柴胡皂苷D蓄積。除此之外，t1/2、CL、Vd和MRT（0-t）分別為單次給藥的1.10、0.95、1.05和1.51倍，差異均在2倍以內。這些數據表明，多次灌胃柴苓舒肝丸，大鼠體內沒有柴胡皂苷D蓄積，與單次給藥相比，主要藥代動力學參數沒有發生顯著改變（見表5）。

表5 大鼠單次和多次灌胃柴苓舒肝丸后柴胡皂苷D的藥代動力學參數比較

大鼠多次灌胃柴苓舒肝丸后，黃芪甲苷的AUC（0-t）和Cmax分別為單次注射的0.98、1.05倍，無明顯變化，說明連續給藥7 d大鼠血液中沒有黃芪甲苷蓄積。除此之外，t1/2、CL、Vd和 MRT（0-t）分別為單次給藥的0.89、1.04、0.91和0.95倍，差異均在2倍以內。這些數據表明，多次灌胃柴苓舒肝丸，大鼠體內沒有黃芪甲苷蓄積，與單次給藥相比，主要藥代動力學參數沒有發生顯著改變（見表6）。

表6 大鼠單次和多次灌胃柴苓舒肝丸后黃芪甲苷的藥代動力學參數比較

2.2 毒理檢測結果分析

2.2.1 臟器濕重結果 灌胃6個月后各組大鼠解剖取臟器稱重。與對照組相比，模型組平均臟器濕重無顯著改變（P＞0.05）；同時各給藥組臟器濕重與模型組相比也無顯著性差異（P＞0.05）（見表7）。

表7 柴苓舒肝丸灌胃給藥對大鼠臟器濕重的影響

2.2.2 臟體系數結果 灌胃6個月后各組大鼠解剖取臟器稱重，并計算臟體系數。與對照組相比，模型組平均臟體系數無顯著改變（P＞0.05）；各給藥組臟體系數與模型組相比也無顯著性差異（P＞0.05）（見表8）。

表8 柴苓舒肝丸灌胃給藥對大鼠臟體系數的影響

2.2.3 HE染色結果 灌胃6個月后各組大鼠解剖取臟器進行HE染色觀察臟器病理改變。與對照組相比，模型組臟器形態無顯著改變（P＞0.05）；各給藥組臟器形態與模型組相比也無顯著性差異（P＞0.05）（見圖5）。綜上所述，可知柴苓舒肝丸具有低的臟器毒性。

圖5 各組大鼠臟器病理圖

3 討論

中藥藥物代謝動力學是一門新興學科，開展中藥藥物代謝動力學研究對闡明和揭示中藥藥效物質基礎和作用機制，設計及優選中藥給藥方案，促進中藥新藥研發、劑型改進及質量控制，均具有重要意義。柴苓舒肝丸屬于水丸，克服了煎煮湯劑流程不可控、攜帶與服用不方便、口感差等缺點，但目前多數中藥制劑的質量控制研究止步于成品本身的性狀、特征及微生物檢測等，而在體內藥動學及毒理學分析方面相對薄弱。因此，本研究在此基礎上，考察了其藥動學特征和臟器毒性，結果發現，以其主要成分柴胡皂苷D和黃芪甲苷為代表，柴苓舒肝丸具有吸收快、分布廣的優點，且在體內沒有蓄積；通過臟器濕重、臟體系數和病理圖結果可知，柴苓舒肝丸具有低臟器毒性的優點。通過探討柴苓舒肝丸的藥物代謝動力學及毒理學，為柴苓舒肝丸進一步的臨床應用奠定基礎。