香茅揮發油提取工藝優化及抗氧化、抑真菌活性研究

王佳麗 張曉南 熊婷婷 牛亞倩 張英迪 徐 福

(東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030)

香茅草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，別名包茅或檸檬草，是多年生禾本科香茅屬草本植物[1]。香茅草常被作為調味料出現在亞洲人的餐桌上[2]。此外，香茅草也被廣泛用于民間偏方，中國云南傣族人將香茅草烘干代茶飲，健胃消脂，治療腹瀉[3]；美國和巴西等國家利用香茅草驅蚊、治療發熱和焦慮癥以及清熱解毒等[4]。現代研究證實，香茅草中具有多種大分子活性物質，其中揮發油在臨床具有多種藥理活性，含有豐富的活性成分，特別是橙花醛和香葉醛，它們具有很好的抗菌功效，對真菌的生長均有抑制作用[5-6]；一些烯烴類、酯類和醛類物質具有抗氧化效果[7]，可以作為天然抗氧化劑添加到食品中[8]；此外，從香茅揮發油中檢測出了波旁烯和欖香烯兩種活性成分，已證實該成分具有抗腫瘤的效果[9-10]。

近年比較常見的天然植物揮發油提取方法包括水蒸氣蒸餾法[11]、超臨界CO2萃取法[12]、索氏提取法[13]、微波輔助法[14]等。但這些傳統方法都有一定的缺陷：水蒸氣蒸餾法使用設備簡單，但提取率很低[15]；索氏提取法的提取率高，但要加入揮發性有毒試劑，具有污染性和潛在危害[15]；超臨界CO2萃取法能保護有效成分，但需要高壓設備，投資大[16]。而微波輔助提取法可以利用微波在極短的時間內提高熱能的傳遞性，縮減加熱梯度，具有提取時間短、節能、操作簡單等優點[14]。近年來，已有學者[17]將微波法用于輔助香茅草揮發油提取，但是由于單因素水平選取差異，使得試驗條件和結果達不到預期效果，出現最佳微波時間和液料比過大的問題，造成了能源的浪費。

研究擬采用微波輔助水蒸餾法提取香茅揮發油，利用GC-MS對香茅揮發油富含的化學成分進行分析，并對香茅揮發油的抗氧化及抑制假尾孢真菌活性進行探究，以期為揮發油產業的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香茅草：采購于廣西壯族自治區的玉林山農戶；

去離子水：東北農業大學；

正己烷：色譜純，天津市光復科技發展有限公司；

無水硫酸鈉：純度≥99%，天津市福晨化學試劑廠；

假尾孢菌：東北農業大學張曉南老師團隊于水果表皮中分離鑒定；

電子天平：JA2003型：上海浦春計量儀器有限公司；

酶標儀：SpectraMax i3x型，東北農業大學；

氣相色譜質譜聯用儀：Agilent 7890A-5975C型，安捷倫科技有限公司；

精密量具游標卡尺：GREENER型，煙臺市綠林工具有限公司；

循環水多用真空泵：SHB-D-Ⅲ型，河南省泰斯特儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A型，上海一恒科技有限公司；

旋轉蒸發儀：RE52CS型，上海亞榮生化儀器廠；

微波爐：M1-L213B型(180～700 W)，廣東美的廚房電器制造有限公司；

恒溫水浴鍋：B-220型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 香茅揮發油的制備 將50 g的干香茅條和一定量的去離子水混合于裝置中加熱，初始溫度為25 ℃，大約30 min后產生揮發油。每隔一定時間記錄一次揮發油讀數，測定揮發油含量，使用無水硫酸鈉干燥揮發油，4 ℃保存備用，采用GC-MS測定并統計揮發油的化學成分。

1.2.2 揮發油提取工藝優化 根據前期預試驗結果，以液料比、微波功率和提取時間為自變量，以揮發油得率為響應值，采用Design-Expert 8.0軟件對揮發油提取工藝條件進行優化。因子編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素和水平Table 1 Factor and levels in response surface analysis

1.2.3 香茅揮發油成分分析 采用氣相色譜—質譜聯用(GC-MS)法[18]。檢測前，揮發油用正己烷稀釋50倍。采用Agilent 7890A氣相色譜Agilent MSD5975C質譜檢測器，使用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，樣品注入量1 μL，噴射器溫度250 ℃，電子電離能70 eV，質量范圍40～400(m/z)。從60 ℃ 以3 ℃/min的速度升溫到250 ℃，持續10 min。采用色譜結合火焰離子化檢測器(GC-FID)，載氣為氮氣(恒定流量1 mL/min，純度99.999%)，進樣器和檢測器溫度均為250 ℃，采用單個峰面積除以所有峰總面積計算相對比例，不考慮響應因子；只包括超過0.1%的化合物。小于0.1%的峰值未計算在內。

1.2.4 抗氧化活性研究

(1) DPPH自由基清除能力：配制0.05 mg/mL的紫色DPPH無水乙醇溶液，根據紫色褪色程度判定揮發油中氫原子或電子得失能力，測定揮發油對DPPH自由基的影響。每個濃度樣品溶液與DPPH乙醇溶液1∶1混合均勻，室溫避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光度，上述試驗重復3次取均值；將樣品溶液替換為等量乙醇溶液作為空白對照；以與樣品溶液同濃度梯度VC溶液作為陽性對照[19]。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%；

A0——DPPH與乙醇混合溶液吸光度值；

A1——DPPH與樣品混合溶液吸光度值；

A2——乙醇與樣品混合溶液吸光度。

(2) ABTS自由基清除能力：ABTS無水乙醇溶液呈天藍色，其褪色程度可判斷揮發油的抗氧化能力，抗氧化能力越強則最大吸收波長734 nm處測得的吸光度值越小。將溶液與ABTS溶液以1∶9混合避光靜置10 min進行測定Ai；將溶液替換為乙醇作為空白對照A0；以與樣品溶液同濃度梯度VC溶液為陽性對照。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%；

A0——乙醇與樣品混合溶液吸光度值；

A1——ABTS與樣品混合溶液吸光度值；

A2——ABTS與乙醇混合溶液吸光度值。

(3)β-胡蘿卜素漂白試驗：將0.2 mg 的β-胡蘿卜素、20 μL亞油酸和200 μL吐溫-20依次溶解于200 μL氯仿溶液中并混合均勻，在40 ℃旋轉蒸發去除氯仿，再加入50 mL無水乙醇溶解即得到β-胡蘿卜素—亞油酸體系；樣品與β-胡蘿卜素—亞油酸溶液按1∶4混合均勻，水浴一定時間，在470 nm處測定抗氧化活性；以同濃度梯度的BHT溶液代替樣品溶液測得陽性對照結果[20]。按式(3)計算自由基清除率。

(3)

式中：

C——亞油酸氧化抑制率，%；

A樣品,0、A對照組,0——t=0時樣品溶液和對照組的吸光度值；

A樣品,2 h、A對照組,2 h——t=2 h時樣品溶液和對照組的吸光度值。

1.2.5 假尾孢菌菌株分離及培養 操作過程在超凈工作臺中進行，使用超凈工作臺前需用75%酒精棉擦拭工作臺，并用紫外燈照射30 min，準備酒精燈并將試驗用具滅菌放入超凈工作臺內。將冷凍的番石榴上的腐爛部位切割成塊狀(10 mm×10 mm)研磨，加入到生理鹽水中震蕩30 s，梯度稀釋至105～107CFU/mL，取樣品100 μL均勻涂抹到固體培養基中，密封置于26 ℃恒溫培養箱中培養48 h，顯微鏡下觀測真菌形態。

1.2.6 MIC和MBC的測定 根據文獻[21]，修改如下：將不同濃度的揮發油溶液加入到含培養基的平板中，使得培養基中所含揮發油最終質量濃度分別為3.0，2.5，2.0，1.5，1.0，0.5 μg/mL，混勻注入培養皿中，待培養基凝固后，使用打孔器將培養好的菌餅切割成直徑為4 mm的圓餅，放置在培養基中心位置，26 ℃下培養1～5 d，觀察菌體生長情況。對揮發油的每一濃度梯度做3組平行試驗，從無菌生長的培養基中找到揮發油濃度最小的培養基，即為該揮發油的最低抑菌濃度，以0.1%的吐溫-80水溶液作為對照。參考最低抑菌濃度試驗結果，制備濃度大于MIC的揮發油加入到液體培養基中，26 ℃培養3 d，對澄清和較為澄清的試管進行涂板，26 ℃培養2～5 d，以無菌落生長的揮發油濃度為最低殺菌濃度。

2 結果與分析

2.1 揮發油提取工藝優化

根據因素水平設計L9(34)試驗見表2。利用Box-Behnken設計原理并采用Design-Expert 8.0軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到各因子對響應值的二次多項回歸模型：

表2 響應面法試驗設計及結果 Table 2 Response surface methodology tests and results

(4)

表3 響應面試驗各因素方差分析? Table 3 Analysis of variance for each factor

由圖1(a)可以看出，隨著液料比從6∶1 (mL/g)增加到10∶1 (mL/g)，微波功率從385 W增加到700 W，揮發油得率也相應地增加，較高的液料比有利于得到更多的提取物，較高的微波功率可以快速破壞植物細胞壁結構，微波處理越強烈，越有利于揮發成分的流出。當液料比和微波功率同時增高時，揮發油得率也增大。圖1(b)顯示揮發油得率隨液料比的增大而升高，當液料比為7∶1 (mL/g)、微波時間為22 min時，揮發油的得率趨于平緩，可能是由于當水溶液體積過大，揮發油溶解在水中不容易揮發出來，再延長提取時間并不能增加得率。圖1(c)中，香茅揮發油的得率也是隨著微波功率、微波時間的增加而增加，但過長的時間并不能增加揮發油得率，當功率達到600 W左右，揮發油得率趨于平緩，過大的功率會導致能耗加。經響應面分析得出微波提取最佳條件為料液比7.185∶1 (mL/g)，功率700 W，時間21.707 min，此時揮發油得率為15.965 mL/kg·DW。在最佳提取條件下再次進行揮發油的提取驗證實驗，重復3次，揮發油得率平均值為16.000 mL/kg·DW，此揮發油得率大于響應面試驗中的數值，說明上述組合條件為揮發油提取最佳條件。

圖1 各因素對揮發油得率影響的響應面圖Figure 1 Response surface diagram of the influence of various factors on the yield of essential oil

2.2 揮發油成分分析

微波輔助提取法和加熱套提取法所得香茅揮發油的離子流色譜圖分別見圖2和圖3，微波輔助提取法中共得到46個峰，共檢出39種成分，占所提揮發油總量的98.63%；加熱套提取法中共得到57個峰，共檢出43種成分，占所提揮發油總量的96.74%。各成分及其相對含量見表4。總體而言，這兩種方法提取的揮發油中的主要成分均為香茅醛和香茅醇，但相對含量存在差異，加熱套提取法的相對含量明顯小于微波輔助提取法的，微波輔助提取法所得到的揮發油中功能成分含量普遍高于加熱套提取的揮發油，兩種工藝都有各自的特點，提取成分種類的不同主要與提取工藝密切相關，揮發油成分含量也存在一定差異。微波加熱會使食品內部分子振動摩擦并迅速產熱，引起食品溫度升高，從而達到快速加熱的目的。與傳統加熱方法相比，微波加熱不僅具有加熱速度快、加熱均勻、對產品的機械損傷小、提取效率高，耗能低等優點，也更是一種符合綠色發展觀念的揮發油提取法。

圖2 微波輔助提取法所得香茅揮發油總離子流圖Figure 2 Total ion flow diagram of citronella volatile oil obtained by microwave-assisted extraction method

圖3 加熱套提取法所得香茅揮發油總離子流圖Figure 3 Total ion flow diagram of citronella volatile oil obtained by heating mantle extraction method

表4 香茅揮發油化學成分的氣相色譜—質譜分析結果Table 4 Gas chromatography-mass spectrometry results for the chemical compositions of citronella essential oil

續表4

2.3 抗氧化活性

香茅揮發油對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50值分別為0.546，1.694 mg/mL，均高于BHT(0.017，0.081 mg/mL)，表明香茅揮發油具有很好的自由基清除能力(表5)。根據表5中數據顯示，香茅揮發油對DPPH自由基、ABTS自由基的清除效率均低于VC與BHT，而抗氧化能力的大小取決于抗氧化劑的濃度及其供氫能力，香茅揮發油是天然抗氧化活性物質，由多種化合物構成；在β-胡蘿卜素漂白試驗中，香茅揮發油抗氧化IC50值為0.145 mg/mL，低于BHT的抗氧化能力0.02 mg/mL，與DPPH自由基和ABTS自由基清除試驗結果一致。以上結論表明香茅揮發油屬于天然抗氧化物，具有安全性、無毒副作用的特點，可用于各類抗氧化產品開發之中，保護生物體免受自由基氧化，因此具有良好的應用前景。

表5 香茅揮發油的抗氧化能力Table 5 Antioxidant capacity of the essential oil from the leaves of citronella mg/mL

2.4 抑真菌試驗

假尾孢真菌包括有上千個品種，從腐敗番石榴中分離的假尾孢真菌是座囊菌綱、球腔菌科下的微生物，廣泛存在于番石榴屬果實表面[22]，為了驗證香茅揮發油對真菌的抑制性，從冷凍的番石榴變質部位進行假尾孢菌分離。假尾孢真菌于26 ℃恒溫培養箱中培養48 h后，經革蘭氏染色，采用電子顯微鏡觀測表面結構如圖4所示，其呈現出絲狀纏繞的狀態，無序排列，未經染色的假尾孢真菌頭部呈黑褐色，尾孢呈乳白色，在生長過程中占空間較大，當假尾孢真菌繁殖到一定數量時，肉眼可見黑褐色頭部覆蓋住尾孢，最終呈片狀分布在培養皿中。

圖4 經革蘭氏染色的顯微鏡下200倍的假尾孢菌Figure 4 Pseudotail bacteria 200 times under the microscope after gram staining

采用瓊脂打孔法[23]測定香茅揮發油的抗真菌能力。

假尾孢菌是無性型真菌屬，生長速度緩慢，因此菌株生長情況觀察總時長為120 h。在24 h時，各培養皿中菌株均無明顯生長，隨時間推移，陸續出現菌落，隨揮發油抑菌液濃度的增大菌落數越少。當揮發油抑菌液的質量濃度為2.0 μg/mL時，對假尾孢真菌的抑制作用不明顯，菌落呈放射狀生長，但當揮發油抑菌液質量濃度為2.5～3.0 μg/mL時，對假尾孢真菌具有較好的抑制效果，但假尾孢真菌在2.5 μg/mL的抑菌液中持續120 h后仍然有一點生長；因此可以得出：在相同時間條件下，隨著香茅揮發油濃度的不斷增大，菌落生長直徑越來越小；該結果表明在單位時間恒定的情況下，揮發油對假尾孢菌的抑制強度與揮發油濃度呈正比例關系，且判斷MIC為2.5 μg/mL，MBC為3.0 μg/mL，由圖5可知，菌株在72 h時的觀察效果已經很明顯，在揮發油質量濃度為2.5 μg/mL 的培養皿中，并未觀察到菌株生長，但是隨時間推移，直到120 h時瓊脂塊周圍出現白色菌落狀物，推測是因為時間的增加使培養皿中揮發油量逐漸減少，抑制作用逐漸消失，可能再延長培養時間，菌落數會越來越多，因此在培養前期就可以確定其MIC值，隨時間推移反而會影響試驗結果的準確性，揮發油濃度的增大抑菌效果也顯著增加。童周[24]研究表明α-松油醇、香茅醇和香茅醛等活性成分具有良好的抑真菌效果，由于香茅揮發油中也富含這幾種成分，因此推測對抑制假尾孢真菌起到了很大作用。這也有利于揮發油抑制真菌以及香茅揮發油對其他真菌方面的研究。

圖5 不同質量濃度香茅揮發油對假尾孢真菌的抑制情況Figure 5 Inhibitory effects of citronella essential oil at different mass concentrations on pseudosporomycetes

3 結論

微波輔助提取香茅揮發油的最佳工藝參數為微波功率700 W、微波時間21.707 min、液料比7.185∶1 (mL/g)，揮發油得率為15.965 mL/kg·DW。GC-MS分析鑒定出39種化合物成分，主要成分為烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物等，這些藥用成分的百分含量比加熱套提取法所得揮發油多。通過DPPH自由基、ABTS自由基以及亞油酸氧化的抑制率評估香茅揮發油的抗氧化性能，分別為92.49%，92.46%，82.23%，且香茅揮發油抑菌液對假尾孢菌的抑制MIC值為2.5 μg/mL，MBC值為3.0 μg/mL。但是微生物種類繁多，香茅揮發油對更多菌種的抑制作用還有待研究。