富硒辣木籽蛋白降壓肽的酶法制備、硒含量及穩定性研究

陳冰冰 楊 奕 李嘉頤 金昶言 程繽霈 鄧泳琪 林碧敏 梁 東 唐德劍 孟 莉 苗建銀

(1. 華南農業大學食品學院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2. 省部共建藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室，廣西 桂林 541004；3. 農業農村部富硒產品開發與質量控制重點實驗室/富硒食品開發國家地方聯合工程實驗室，陜西 安康 725000；4. 安康市富硒產品研發中心，陜西 安康 725000)

全球高血壓患者人數逐年增加，預計到2025年，發病人數將超過15億[1-2]。降壓肽又稱血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽，主要通過降低ACE活性來降低血壓，而ACE在腎素—血管緊張素系統中起著關鍵作用[3]。目前，ACE抑制劑是治療高血壓的主要藥物，但臨床上服用合成ACE抑制劑的患者存在不同程度的副作用，如頭痛、疲勞、咳嗽、水腫、皮疹等[4-6]。而從蛋白質酶解產物中分離出的ACE抑制肽具有效果溫和、專一、高效和無副作用等特點，具有良好的開發價值[7]。植物蛋白制備血管緊張素轉換酶抑制肽因其成本低、安全性高、無毒副作用而成為研究熱點，如從黑豆蛋白[8]、魔芋蛋白[9]、綠茶渣蛋白[2]、玉米蛋白[10]等酶解物中發現具有ACE抑制活性的多肽，并開發出了多種相關產品。

硒(Se)是人和動物的必需微量元素之一，參與硒酶和硒蛋白的形成，在調節氧化還原平衡、物質代謝、發育與生殖及免疫功能方面發揮重要作用[11]。此外，硒還具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗病毒[14]、提高機體免疫力[15]、預防心腦血管疾病[16]等生理功能。與無機硒相比，天然有機硒具有低毒性、生物利用率高和多種生理活性等優點，目前已從富硒大豆[17]、富硒大米[18]、富硒茶[19]中分離并鑒定出了含硒肽。

辣木(MoringaoleiferaLam.)是一種生長在熱帶和亞熱帶的藥食兩用植物[20-21]，其葉被中國綠色食品發展中心認定為“國家首推綠色食品”[22]，具有多種生理保健活性。研究發現，辣木籽是一種具有多種生理活性的天然原料，具有降糖尿病[23]、抗炎和緩解腹痛[24]等功能。研究擬以富硒辣木籽蛋白為原料，優化富硒辣木籽蛋白中具有ACE抑制活性肽的酶解制備工藝，并評價最優條件下降壓肽的穩定性及硒含量，旨在為富硒辣木籽蛋白資源的利用和天然富硒降血壓肽的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

富硒辣木籽蛋白粉：北部灣濱海富硒功能農業研究院；

堿性蛋白酶(20萬U/g)、胃蛋白酶(300萬U/g)、木瓜蛋白酶(20萬U/g)、胰蛋白酶(25萬U/g)：廣西南寧龐博生物工程有限公司；

血管緊張素轉化酶(ACE，來源于兔肺)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)：美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設備

數顯恒溫水浴鍋：HH-4型，金壇市華城海龍實驗儀器廠；

冷凍干燥機：FD-1型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

pH計：PHS-3CW型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；

電熱恒溫培養箱：DH5000BII型，天津泰斯特儀器有限公司；

臺式低速自動平衡離心機：L530型：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

多功能酶標儀：2300型，美國PerkinElmer公司；

原子熒光光度計：AFS-9530型，北京海光儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 富硒辣木籽蛋白降壓肽制備 稱取一定量的富硒辣木籽蛋白粉，加入蒸餾水配制成一定濃度的蛋白質溶液，調節pH，加入一定量的酶，沸水浴滅酶，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，測定ACE抑制率。

1.2.2 蛋白酶初篩 以富硒辣木籽蛋白為原料，選取4種蛋白酶在其最適條件下酶解，分別為堿性蛋白酶(pH 8.5，55 ℃)、胃蛋白酶(pH 2，37 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 6.5，55 ℃)、胰蛋白酶(pH 8，37 ℃)。其余試驗條件：底物濃度5%，酶底比0.3%，酶解時間3 h，滅酶，離心，取酶解液用蒸餾水稀釋10倍，測定ACE抑制率，選擇制備富硒辣木籽蛋白降壓肽的最佳酶。

(1) 酶解時間：在最適蛋白酶的基礎上，固定胰蛋白酶酶解溫度37 ℃，pH 8，底物濃度5%，酶底比0.3%，考察酶解時間(1，2，3，4，5 h)對富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

(2) 酶解溫度：在最適蛋白酶的基礎上，固定胰蛋白酶酶解時間3 h，pH 8，底物濃度5%，酶底比0.3%，考察酶解溫度(27，32，37，42，47 ℃)對富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

(3) pH：在最適蛋白酶的基礎上，固定胰蛋白酶酶解時間3 h，酶解溫度37 ℃，底物濃度5%，酶底比0.3%，考察pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)對富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

(4) 底物濃度：在最適蛋白酶的基礎上，固定胰蛋白酶酶解時間3 h，酶解溫度37 ℃，pH 8，酶底比0.3%，考察底物濃度(1%，3%，5%，7%，9%)對富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

(5) 酶底比：在最適蛋白酶的基礎上，固定胰蛋白酶酶解時間3 h，酶解溫度37 ℃，pH 8，底物濃度5%，考察酶底比(0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%)對富硒辣木籽蛋白酶解物ACE抑制活性的影響。

1.2.4 響應面優化 基于單因素試驗結果，以底物濃度、酶解溫度和酶解時間為自變量，以ACE抑制率為響應值，根據Box-Behnken中心組合設計原理進行三因素三水平響應面試驗，優化降壓肽的最佳制備工藝。

1.2.5 最優酶解液的超濾分離 將最佳條件下獲得的酶解液用10 kDa的超濾膜進行超濾，收集<10 kDa和>10 kDa組分冷凍干燥，密封保存備用。

1.2.6 ACE抑制率測定 根據文獻[25]。

要進一步推進大學生的社會實踐,建立完善的社會實踐評價機制勢在必行。在評價考核的時候,學校應該更加重視學生的實踐成果，做好實踐活動的評價反饋，使學生能明確自己的不足之處，并在之后的學習中不斷完善自己。學校應加強與社會實踐單位的溝通，與所在單位負責人進行時時聯系,加強對學生社會實踐的過程管理，以便切實了解學生的社會實踐狀況，從而進一步完善學校、學生和實踐單位三者間的互動和溝通。

1.2.7 硒含量測定 按GB 5009.93—2017執行。

1.2.8 富硒辣木籽蛋白降壓肽的穩定性分析 根據最優條件制備ACE抑制酶解液，凍干即得富硒辣木籽降壓肽粗肽粉，配制質量濃度為5 mg/mL的多肽溶液，以ACE抑制率為指標，分別考察溫度、pH及體外模擬胃腸道酶系對富硒辣木籽降壓肽穩定性的影響。

(1) 溫度：根據文獻[26]。

(2) pH：根據文獻[26]。

(3) 模擬胃腸道消化：根據文獻[26-27]并修改。將富硒辣木籽蛋白降壓肽用0.1 mol/L的HCl調節pH為2，加入質量分數為1%的胃蛋白酶，37 ℃水浴3 h，滅酶10 min，冷卻，用1 mol/L的NaOH調節pH為7，4 000 r/min 離心10 min，測定上清液的ACE抑制率。取離心前pH為7的溶液，加入質量分數為1%的胰蛋白酶，37 ℃水浴3 h，滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，測定上清液的ACE抑制率。

1.2.9 數據處理 使用SPSS 21.0軟件進行數據處理，字母不同表示在P<0.05范圍內存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶初篩

由圖1可知，4種蛋白酶的酶解效果分別為胰蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胃蛋白酶，且差異顯著(P<0.05)。胰蛋白酶水解富硒辣木籽蛋白產物具有最高的ACE抑制率(68.86%)，其酶切位點優先在精氨酸和賴氨酸處裂解，C末端Arg或Lys的存在能增強ACE抑制活性[28-30]。因此，選擇最佳酶為胰蛋白酶。

圖1 蛋白酶種類對酶解物ACE抑制率的影響Figure 1 Effects of protease species on ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysates

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶解時間對酶解效果的影響 由圖2可知，當酶解時間<3 h時，ACE抑制率隨酶解時間的增加而顯著升高(P<0.05)；當酶解時間>3 h時，ACE抑制率有輕微下降，可能是由于酶解反應在3 h內持續進行，富硒辣木籽蛋白被不斷水解，使得具有抑制ACE活性的肽不斷積累，ACE抑制率則不斷增強；進一步延長反應時間(>3 h)，富硒辣木籽的蛋白質底物被完全分解，而胰蛋白酶仍具有活性，會分解新生成的肽產物，導致活性肽含量降低，抑制活性降低。實際生產中，在不降低目標產物ACE抑制活性前提下，可以縮短酶解時間使生產效率最大化，故確定最佳酶解時間為3 h。

圖2 時間對ACE抑制率的影響Figure 2 Effect of time on ACE inhibition rate

2.2.2 酶解溫度對酶解效果的影響 由圖3可知，隨著催化酶解反應溫度的不斷升高，水解產物對ACE的抑制作用明顯增加(P<0.05)，當反應溫度為37 ℃時，ACE抑制率最大為66.88%。隨著酶解溫度的升高，胰蛋白酶的活性逐漸增大，與底物的接觸幾率增大，水解效率增加，ACE抑制活性也隨之增加。但當酶解溫度超過最適溫度(37 ℃)后繼續增高，過高的酶解溫度可能導致胰蛋白酶變性失活，底物不能被有效地水解，降低了對底物水解后產物ACE的抑制效果[31-32]。故選擇最佳酶解溫度為37 ℃。

圖3 酶解溫度對ACE抑制率的影響Figure 3 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibition rate

2.2.3 pH對酶解效果的影響 由圖4可知，ACE抑制率隨酶解pH的增大先上升后下降，當pH為8時達最大值66.67%。pH值是影響酶解效果的重要因素，其影響體現在蛋白酶構象、酶與蛋白質的結合狀態等方面，過高或過低的pH都不利于酶解[33-34]。pH 8是胰蛋白酶的最適pH值，此時酶活性最強，水解效率也最高，水解后的產物中含有更多的活性短肽，ACE抑制率高，但當pH低于或高于8時，胰蛋白酶活性下降，富硒辣木籽蛋白被胰蛋白酶催化水解效率下降，具有ACE抑制活性的短肽數目減少，ACE抑制率降低。故選擇最佳pH為8。

圖4 pH對ACE抑制率的影響Figure 4 Effect of pH on ACE inhibition rate

2.2.4 底物濃度對酶解效果的影響 由圖5可知，當底物濃度為1%～5%時，ACE抑制率隨底物濃度的增加而顯著增加(P<0.05)，當底物濃度為7%時，ACE抑制率達最高值68.78%，可能是由于通過增加底物濃度來增加反應體系中底物與酶分子的碰撞機會，從而提高了酶解反應速度[35]。當底物濃度不斷增加，抑制劑的效果反而降低，一方面可能是因為沒有足夠的酶催化底物反應，另一方面由于酶解液過于黏稠，影響蛋白質的自由擴散，影響酶解效率，從而影響抑制率[36]。故選取最佳底物濃度為7%。

圖5 底物濃度對ACE抑制率的影響Figure 5 Effect of substrate concentration on ACE inhibition rate

2.2.5 酶底比對酶解效果的影響 由圖6可知，ACE抑制率隨酶底比的增加呈先增大后緩慢降低的趨勢，當酶底比為0.1%～0.3%時，ACE抑制率顯著增加(P<0.05)，且在0.3%達最大值68.85%。而后繼續增大酶底比，ACE抑制率緩慢降低(P>0.05)，主要是因為酶底比較低時，與蛋白底物結合未完全達到一定的飽和，隨著酶底比的增加，酶與底物結合越來越接近飽和，由于底物蛋白有限，過多的蛋白酶無法作用蛋白進行水解，因此，抑制率變化緩慢。此外，酶解物被水解后含有更多不具有ACE抑制活性的小肽片段，導致活性降低[37-38]。故選取最佳酶底比為0.3%。

圖6 酶底比對ACE抑制率的影響Figure 6 Effect of enzyme/substrate on ACE inhibition rate

2.3 響應面優化

在單因素基礎上，選取底物濃度、酶解溫度和酶解時間3個因素為優化因素。響應面因素水平設計見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

各因素經二次多項回歸擬合后，得回歸方程為：

Y=71.34+0.11A-2.45B-0.78C+0.89AB-1.56AC-1.34BC-2.52A2-2.30B2-3.86C2。

(1)

由表3可知，模型顯著(P=0.012 4<0.05)，失擬項不顯著，說明回歸模型理想，可以用來擬合底物濃度、酶解溫度和酶解時間3個因素對水解產物ACE抑制率的影響。一次項B和二次項C2對ACE抑制率影響極顯著(P<0.01)，二次項A2和B2對ACE抑制率影響顯著(P<0.05)。

表3 響應面二次模型方差分析?Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic model

由圖7可知，各因素對酶解液ACE抑制率的影響為酶解溫度>酶解時間>底物濃度。根據回歸模型，得到最佳酶解工藝為底物濃度6.84%，酶解時間3.01 h，酶解溫度34.25 ℃。考慮實際生產情況，將工藝調整為底物濃度7%，酶解時間3 h，酶解溫度34 ℃，此條件下，酶解液ACE抑制率預測值為72.01%，實測值為71.34%，與理論值誤差<1%，說明該模型獲得的最佳酶解工藝是可靠的。

圖7 各因素相互作用對ACE抑制率影響的響應面圖Figure 7 Response surface diagram of the influence of each factor interaction on ACE inhibition rate

2.4 最優酶解物及超濾組分對ACE抑制活性的影響

由圖8可知，在質量濃度范圍內，ACE抑制率隨質量濃度的增加顯著上升(P<0.05)，當質量濃度為4 mg/mL時，ACE抑制率由高到低為分子量小于10 kDa組分(78.88%)>最優酶解物(67.00%)>分子量大于10 kDa組分(62.71%)，相應的IC50值分別為1.859，1.956，3.426 mg/mL，表明分子量小于10 kDa組分的ACE抑制率最高，顯著高于最優酶解物和分子量大于10 kDa組分(P<0.05)。ACE抑制率隨富硒辣木籽多肽分子量的降低而升高，與陳龍等[39-40]的結論一致。

圖8 富硒辣木籽蛋白酶解物及超濾組分對 ACE的抑制率Figure 8 ACE inhibition rate of Se-enriched Moringa oleifera seed protein hydrolysates and ultrafiltration components

2.5 硒含量

試驗發現，富硒辣木籽蛋白原料和富硒辣木籽降壓肽中硒含量分別為1.269，1.394 mg/kg，表明富硒辣木籽蛋白經酶解篩選后硒被富集。劉戀等[41]測得恩施富硒大豆蛋白粉中硒含量為1.068 8 mg/kg，劉波等[42]測得富硒大米中硒含量為0.167 5 mg/kg。此外，富硒螺旋藻蛋白獲得的硒肽具有較高的ACE抑制率[43-44]，且富硒大豆低聚肽的降血壓作用主要是硒與肽的協同作用[17]。綜上，富硒辣木籽蛋白是一種硒含量較高的植物蛋白資源，是富硒辣木籽蛋白肽的制備及分離純化的優良天然富硒原料。

2.6 富硒辣木籽蛋白降壓肽的穩定性

2.6.1 溫度對辣木籽降壓肽穩定性的影響 由圖9可知，當溫度為20～100 ℃時，降壓肽的ACE抑制率為79.17%～84.85%，說明ACE抑制率在溫度20～80 ℃時變化不顯著(P>0.05)；當溫度為100 ℃時，ACE抑制率為79.17%，相對于其他溫度處理下顯著降低(P<0.05)，但比例變化與其他溫度處理下相比不超過6%。總體看來，ACE抑制活性受溫度的影響較小，在一定范圍內降壓肽表現出良好的溫度穩定性，與Hwang等[45]和王珊珊[46]的試驗結果一致。

圖9 富硒辣木籽ACE抑制肽的溫度穩定性Figure 9 Temperature stability of ACE inhibitory peptides from Se-enriched Moringa oleifera seed

2.6.2 pH對辣木籽降壓肽穩定性的影響 由圖10可知，當pH為10時，ACE抑制率為83.91%，相對于pH 2～8時顯著降低(P<0.05)，可能是因為降壓肽在一定堿性環境下出現了快速消旋，改變了肽鏈結構，降低了多肽活性[47]，但與最高值相差≤6%。因此，pH對富硒辣木籽降壓肽的ACE抑制活性存在一定影響，但幅度不大，降壓肽在強酸或強堿條件下繼續維持較完整的酶體結構及活性。這與Li等[8]和周劍敏等[26]的試驗結果一致。

圖10 富硒辣木籽ACE抑制肽的酸堿穩定性Figure 10 pH stability of ACE inhibitory peptides from Se-enriched Moringa oleifera seed

2.6.3 模擬胃腸道消化對辣木籽降壓肽穩定性的影響

由圖11可知，與未消化的降壓肽相比，胃蛋白酶水解的降壓肽和胃蛋白酶與胰蛋白酶共同作用的降壓肽的抑制率未明顯降低(P>0.05)，說明富硒辣木籽降壓肽活性不受胃腸蛋白酶的影響，具有良好的體外消化穩定性，與Antonio等[48]和羅鵬等[49]的研究結論一致。

圖11 富硒辣木籽ACE抑制肽的體外消化穩定性Figure 11 In vitro digestion stability of ACE inhibitory peptides from Se-enriched Moringa oleifera seed

3 結論

以富硒辣木籽蛋白粉為原料，以血管緊張素轉化酶抑制率為指標，優化了富硒辣木籽蛋白降壓肽的酶解工藝，并分析了酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性、硒含量和穩定性。結果表明，富硒辣木籽蛋白降壓肽的最佳酶解工藝為酶解時間3 h，酶解溫度34 ℃，pH 8，底物濃度7%，酶底比0.3%。該條件下制備的血管緊張素轉化酶抑制肽的硒含量是辣木籽蛋白原料的1.1倍。此外，該降壓肽還具有良好的溫度、酸堿和體外胃腸道消化穩定性。后續將對富硒辣木籽肽進行純化鑒定、體內外活性評價、構效關系研究等，以明確其降血壓作用機制。