信陽地區番茄果腐病病原菌的分離鑒定

谷清義，梅 陽，耿曉桐，張耀洲，申 君

（信陽農林學院，河南信陽 464000）

番茄（）是一年生茄科植物，原產于南美，因其獨特的風味和較高的營養價值而成為全球蔬菜的主要栽培品種，成為全球消費最多的蔬菜之一。番茄在生長過程中病害多達20多種。其中，番茄果腐病是果實成熟與貯藏期極易發生的一種病害，嚴重影響番茄的品質。番茄果腐病的危害以成熟果實為主，發病初期果面呈現淺色斑，后期病斑呈褐色，無清晰邊緣，擴大后布滿整個果面。嚴重時引起果實腐爛，脫落。

番茄果腐病在信陽地區多有發生，嚴重影響番茄的產值和品質。本試驗以信陽市甘岸鎮蔬菜大棚采摘的番茄為研究對象，采用組織分離法對病原菌進行分離純化，利用柯赫氏法則進行致病性測定，并結合形態特征和18S rDNA-ITS 基因序列對病原菌進行初步鑒定，為進一步研究信陽番茄病害的發生規律及防治提供理論依據，以期為培育抗番茄果腐病材料提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：采自信陽市甘岸鎮大棚番茄，貯藏期間自然發病的果實。

接種材料：新鮮、健康的番茄，購自超市。

PDA 培養基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、無菌蒸餾水定容至1000 mL（高壓蒸汽121℃滅菌20 min）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化

采用組織分離法進行病原菌的分離純化。在超干凈工作臺上，于發病果的病健交界處取約3 mm×3 mm 的塊狀果皮組織，用體積分數75%的酒精消毒15 s，3%的NaClO 溶液消毒15 s，無菌水沖洗4 次，用無菌濾紙吸掉表層水分。將組織塊轉移到PDA 平板上，在25℃恒溫箱中培養，待菌落長出后挑取邊緣菌絲進行純化培養，重復3 至4 次純化培養，獲得的純化菌株在4℃條件下保存備用。

1.2.2 病原菌的致病性測定

按照柯赫氏法則對分離到的病原菌進行致病性測定。將分離得到的病原菌在PDA 上25℃黑暗培養5 d，將病原菌用無菌蒸餾水制成濃度1×10個/mL的孢子懸液。選取無病健康的番茄果實，用2%的NaClO 溶液浸泡2 min，無菌水沖洗并晾干。用滅菌過的接種針在番茄果實表面刺出傷口，在傷口處接種孢子懸液30 μL；設5 次重復，以清水作對照，置于25℃保濕培養，待發病后從接種發病的果實上再次分離出致病菌株病原菌，完成柯赫氏法則驗證。

1.2.3 病原菌的形態學鑒定

將菌株轉接到PDA 培養基上，置于恒溫箱中25℃恒溫培養，每天觀察菌株在培養基的生長狀況，5 d 后在光學顯微鏡下觀察菌落的培養特征、菌絲體形態、分生孢子的形態以及有無分生孢子梗等特征，根據病原菌的形態特征，初步判斷病原菌的分類地位。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

將菌株轉接到PDA 培養基上培養，5 d 后菌絲布滿培養皿。刮取新鮮菌絲，采用CTAB 法提取FQ-1菌株的總DNA。對FQ-1 菌種的DNA 進行PCR擴增，PCR 擴增采用真菌核糖體DNA 通用引物ITS1 和ITS4，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCT TATTG ATATGC-3’。將PCR 擴增后得到的產物送到武漢擎科生物科技有限公司測序，測序結果與GenBank 中相關序列進行比對分析，以確定FQ-1 菌株類別。

2 結果與分析

2.1 病原菌FQ-1 的發病癥狀和分離

利用組織分離法從10 份番茄病果上分離培養并純化后，獲得6 株病原菌，將其中一株優勢菌株命名為FQ-1，進行后續試驗。該病害危害番茄成熟的果實（圖1A），發病部位有形成不規則的圓形、白色乃至黃白色病斑，病斑處略凹陷有白色絮狀菌絲，后期病斑變成暗黃色，果實腐爛，散發出異味。

2.2 病原菌FQ-1 的致病性檢測

將分離得到的病原菌FQ-1 采用離體刺傷接種法接種于健康果實表面（圖1B）。接種3d 后番茄表面有明顯病斑，導致番茄表面形成圓形，黃白色、水漬狀病斑，病斑凹陷能看到清晰邊緣，隨后變成暗黃近褐色，病部褐變軟腐，有異味，與自然番茄發病的癥狀相同。對回接發病果實進行再分離，獲得與接種菌菌落特征一致的分離物，說明分離病原物為致病菌。

圖1 番茄果腐病自然發病（A）和人工接種（B）癥狀

2.3 FQ-1 菌株形態學鑒定

從自然發病的番茄上分離出病原菌，經形態學初步鑒定，屬于鐮刀菌屬（）。將分離到的病原菌依照柯赫氏法則回接鑒定，發現為致病菌株。

FQ-1 菌在PDA 培養基上培養時生長迅速（圖2A），3d 菌落直徑達到52 mm，大量氣生菌絲初期為白色后變為暗黃色，PDA 培養基背面為白色或米黃色。分生孢子頂細胞彎曲（圖2B），兩端尖，具單隔膜，無色透明；未見厚垣孢子，分生孢子大小不一，內部有0～3 個隔膜。

圖2 番茄果腐病病原菌FQ-1 形態特征

2.4 FQ-1 菌種的分子鑒定

提取病原菌FQ-1 的總DNA，對rDNA-ITS 基因序列進行PCR 擴增，獲得的基因片段大小為565 bp，將獲得的 rDNA-ITS 序列（登錄號：ON993227）與GenBank 上的序列進行比對，發現其與（MT032393）、（MT012109）、（MK228625）、sp.（GQ352485）、（MG020430）、（MT032394）等6 種鐮刀菌的同源性都99%以上。因此初步確認FQ-1 菌株是鐮刀菌，仍需對其序列和序列進行測定，將FQ-1菌種鑒定到種。

3 結論與討論

番茄因果皮薄、組織柔嫩多汁并富含糖分，采后儲存過程中容易感染微生物而發病腐爛。番茄成熟期或采后病害主要是果腐病。番茄果腐病的主要原因是病原菌的入侵。有研究表明，引起番茄果腐病的病原菌主要有尖孢鐮刀菌（）、灰葡萄孢（）、擴展青霉（）和立枯絲核菌（）等。本試驗通過對信陽市甘岸鎮大棚番茄進行形態學鑒定和分子生物學鑒定，初步確定從番茄上分離純化得到的病原菌FQ-1 為鐮刀菌，與王振學等從番茄中分離的病原菌為尖孢鐮刀菌相同。鐮刀菌（）廣泛存在于自然界中，是一類重要的植物病原真菌，能夠引起寄主產生根腐、萎蔫、葉斑、果腐等癥狀，危害果實比較嚴重，綠果和紅熟果都可以發病，紅熟果發病更嚴重。鐮刀菌除引起番茄果腐病外，還能造成番茄枯萎病、甘草根腐病、豌豆根腐病、蠶豆苗期根腐病、馬鈴薯根腐病等。

本試驗利用rDNA-ITS 序列僅鑒定出果腐病菌屬于鐮刀菌，而未將FQ-1 菌株鑒定到種，接下來需對其序列和序列進行測定，對其進行準確鑒定，并對其生物學特性和防治藥劑進行研究。