基于ITS序列對幾株野生大型真菌的鑒定

朱 鏈，侯怡鈴，白 鑫，丁 祥

(西華師范大學 a.生命科學學院，b.西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，c.環境科學與工程學院，四川 南充 637009)

通過觀察真菌的生長環境，比較真菌形態或微觀特征，再結合生理、生化和營養實驗的傳統真菌鑒定方法需要有豐富的真菌鑒定工作經驗，而且還需要大量的時間。許多真菌的生長條件特殊，形態相似性較高，僅通過傳統的表型特征來識別，難免會產生假陽性或假陰性結果，因此很難準確鑒定[1-2]。隨著分子生物學的迅速發展，真菌基因組的組成也逐漸被發現。真菌基因組中有4個編碼核糖體rRNA的基因，包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA[3-4]。18S至28S之間的rDNA片段含有片段化的真菌核糖體基因轉錄間隔區(ITS)，該區域的核苷酸序列隨時間變化非常緩慢，可用于相對較遠生物體的進化比較。因此對rDNA的序列分析可用于鑒定未知分子量或驗證表型鑒定結果[5-7]。但是，對未知真菌的識別如果僅基于編碼rDNA的序列分析，會因為大量相似序列而增加菌種鑒定的難度，不同物種之間相似序列的差異非常小，有的可達到99%的相似性[8-11]，傳統的分類方法可以在這時更好地輔助確定菌種類型。

四川宜賓老君山位于四川南部，有較原始的森林植被，雨量充沛，光照適宜，土壤有機質豐富，適宜真菌生長。真菌采集地海拔1 193 m，北緯27°50′，東經103°36′。本研究對采自四川宜賓老君山地區的6株菌株進行分類鑒定，判斷是否有真菌新種，并為后續真菌種類鑒定提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

真菌樣品于2019年8月采集于四川宜賓老君山地區(標記為1、3、4、5、8、26號)，采集過程中記錄其生活環境、生物習性，拍照記錄，然后將其晾干帶回西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，儲存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑和儀器

2x Taq PCR MasterMix(天一輝遠)，DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)，DNA純化回收試劑盒(天根生物科技有限公司)，PCR引物(成都生工生物技術公司)，乙醇等化學試劑(成都金山化學試劑有限公司)，ddH2O(實驗室自制)。

臺式離心機Mikro 120(MIKRO)，PCR儀 Thermal Cycler 2720(Applied Biosystem)，電泳儀DYY-6C(北京六一)，紫外分析儀Gel DocTMXR+(BIO-RAD)，ABI 3730 XL(Applied Biosystem)。

1.3 實驗方法

1.3.1 傳統分類法鑒定

根據6種真菌形態學特征并參照《中國大型真菌彩色圖譜》[12]《中國大型菌物資源圖鑒》[13]《中國真菌志》[14-16]鑒定種屬。

1.3.2 真菌總DNA提取

取10 mg菌體剪碎，迅速加入液氮研磨成粉狀，轉移至2 mL離心管。65 ℃水浴30～40 min。參照DNA提取試劑盒說明提取總DNA，將其加入3%瓊脂糖凝膠中電泳以檢測是否提取到真菌DNA。根據DNA純化回收試劑盒說明回收提取的DNA。提取到的總DNA放入-20 ℃冰箱保存以待擴增。真菌基因組ITS序列PCR擴增參考文獻[17]。

1.3.3 PCR結果檢測

取擴增反應產物5.0 μL并與6×Loading Buffer混勻，在含有10 mg·mL-1Gold View的3%瓊脂糖凝膠上點樣，將含有樣品的瓊脂糖放在1.0×TAE緩沖液中電泳，電壓為120 V。當出現的條帶離點樣孔大約距離整個膠的2/3處時停止電泳，取出凝膠放在凝膠成像系統中，觀察并拍照。

1.3.4 PCR產物純化以及測序

將500～700 bp左右的目的條帶小心用無菌手術刀割下，參照凝膠回收試劑盒說明進行回收純化，將純化后的PCR產物送成都生工生物技術公司進行上下游引物雙向測序。

1.4 進化樹的構建

將測序結果上傳至GenBank獲得登錄號，在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫下載登記序列中含有與該6種序列相似度高的片段，利用DNAMAN 8軟件對序列進行分析，然后截去兩側擴增差異較大的堿基對，使比對的序列大小幾乎一致，再用Clustalx軟件進行完全比對，利用MEGA 7.0軟件采用鄰位相連法(N-J，neighbor-joining)構建系統進化樹[18-21]。

2 結果與分析

2.1 傳統分類法的最初鑒定結果

6株野生真菌的生境如圖1所示，依據其生境和菌蓋、菌褶、菌柄等特征，初步鑒定結果為：1號為棒束孢屬(Cordyceps)，3號濕傘菌屬(Hygrocybe)，4號珊瑚菌屬(Clavaria)，5號銀耳屬(Pseudohydnum)，8號小菇菌屬(Mycena)，26號擬鎖瑚菌屬(Clavulinopsis)。

2.2 PCR擴增結果

提取6株真菌菌株總DNA進行PCR擴增，擴增產物進行凝膠電泳后均能在500～750 bp出現目的條帶(圖2)，表明擴增出的片段可以進行后續建樹。

2.3 DNA-ITS序列測序與比對結果

6株真菌的登錄號如下：1號真菌樣品登錄號為OL617416，3號真菌樣品登錄號為OL617418，4號真菌樣品登錄號為OL617419，5號真菌樣品登錄號為OL617420，8號真菌樣品登錄號為OL616140，26號真菌樣品登錄號為OL616134。N-J系統發育樹如圖3所示。在序列比對時，兩個不同序列相似性達到90%可以鑒定為同種[22-25]，1號真菌樣品與大草蟬草菌(Cordycepscicadae)有高達98%的相似度，3號真菌樣品與雞油菌狀濕傘(Hygrocybecantharellus)有高達99%的相似度，4號真菌樣品與碎白珊瑚菌(Clavariafragilis)有高達99%的相似度，5號真菌樣品與膠質刺銀耳菌(Pseudohydnumgelatinosum)有高達99%的相似度，8號真菌樣品與盔蓋小菇菌(Mycenagalericulate)有高達99%的相似度，26號真菌樣品與環溝擬鎖瑚菌(Clavulinopsissulcate)有高達99%的相似度。

3 討 論

結合運用傳統分類和ITS序列分析法對四川宜賓老君山地區采集的6株菌株進行了鑒定。受真菌生境影響，許多真菌的形態特征具有較高的相似性，且傳統分類法對鑒定者的經驗豐富度要求較高，因此僅依靠該方法對真菌鑒定可能存在較大難度[26]，故根據傳統分類法花費了很多時間查閱資料才將6株菌株鑒定出來，將6株菌株進行初步分類時僅鑒定到屬。應用分子生物學方法鑒定物種的關鍵是要獲得純度較高、量多且穩定的DNA模板，因而碾磨菌體就尤為關鍵[27]，碾磨時要迅速充分，否則提取到的DNA就不夠或不純。序列比較和分析中，由于基因庫不斷完善，不同物種的ITS序列出現了較多的相似序列，在選擇序列進行建樹時要綜合考慮這些序列和目的序列的相關性，選擇出與目的序列相同科屬的真菌序列。可選擇幾個具有較高相關性的同種真菌的不同序列建樹，以提高可信度。結合rDNA-ITS序列分析法對6株菌株進一步在種層次進行鑒定，結果顯示rDNA-ITS序列分析法鑒定出的菌種所歸的屬與傳統分類法鑒定出的屬相互契合。總體來說，形態學分類仍然在真菌分類學上起到舉足輕重的作用。在真菌鑒定過程中依據真菌形態、生理特征、生態特征鑒定出屬，再結合分子序列鑒定到種，二者結合綜合分析可使分類鑒定更準確客觀。