HPLC測定化妝品中4種大麻酚類成分的檢測方法

曹菲斐，丁雯倩，鄔曉鷗，龐學斌，邱穎姮，王曉煒

(深圳市藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局化妝品監測評價重點實驗室，廣東 深圳 518057)

大麻(CannabissativaL.)是桑科大麻屬植物，富含萜類、黃酮類、生物堿類等多種成分。大麻類提取物具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗菌作用，在化妝品中具有舒緩修復、抗老化、祛痘等功效[1]；大麻仁果、大麻籽油、大麻葉提取物曾收錄于《已使用化妝品原料名稱目錄(2015版)》中，目前市場上存在含大麻類成分的化妝品[2]。根據國家禁毒管理相關政策要求，2021年5月28日，國家藥監局發布關于更新化妝品禁用原料目錄的公告，將大麻二酚列為化妝品禁用原料、大麻仁果、大麻籽油、大麻葉提取物列為禁用植物原料。自公告發布之日起，化妝品注冊人、備案人不得生產、進口產品配方中使用了上述原料的化妝品。

大麻中含有的大麻酚標志性化合物主要為Δ9-四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC)、大麻二酚(Cannabidiol，CBD)和大麻酚(Cannabinol，CBN)，占大麻酚類化合物的90%以上[3]。其中Δ9-THC具有精神活性，可產生致幻及成癮效果，被聯合國列為“麻醉品”或“毒品”[4]，其在新鮮的大麻組織中主要以Δ9-四氫大麻酚酸A(Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A，Δ9-THCA-A)的形式存在，在干燥、陳化、加熱或焚燒后THCA-A通過脫羧反應轉化為THC，瑞士等歐洲國家已立法要求以游離的Δ9-THC及Δ9-THCA-A含量總和確定大麻原植物是否為毒品大麻[5]。在歐盟《化妝品法規 1223/2009》中，附錄Ⅱ禁用組分列表包含大麻和大麻樹脂與大麻浸膏和酊、四氫大麻酚、屈大麻酚、六氫大麻酚等物質；在加拿大化妝品限用組分清單中，收錄的大麻來源原料限制要求四氫大麻酚含量應低于10 μg/g。

目前研究文獻報道的大麻酚類化合物的檢測主要針對大麻植物、大麻提取物及火麻仁油[6-12]，化妝品中大麻酚化合物的檢測僅限于大麻二酚[13-14]，尚無化妝品中多種大麻酚類成分的檢測研究。為全面監測化妝品中所含的大麻酚類化合物，本文建立HPLC法測定化妝品中Δ9-四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚酸A的方法，為進一步開展化妝品監測評價活動提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

Alliance e2695-2998高效液相色譜儀，美國沃特世公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；AgilentZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國安捷倫公司；AG135電子天平(十萬分之一)，瑞士梅特勒公司；KQ-250E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Synergy R System純水器，默克密理博公司。

1.2 試劑與耗材

乙酸銨(色譜純)，ACROS ORGANICS;磷酸二氫鉀(分析純)，阿拉丁公司；甲酸(色譜純)，FLUKA公司；乙酸(色譜純)，Avantor Performance Materrials；甲醇、乙腈(色譜純)，默克公司；有機濾膜(0.45 μm疏水型)，津騰公司。Δ9-四氫大麻酚對照品溶液(100.0 μg/mL)、大麻二酚對照品溶液[(1.000±0.006) mg/mL]、大麻酚對照品溶液[(1.000±0.006) mg/mL]、Δ9-四氫大麻酚酸A對照品溶液[(1.000±0.006) mg/mL]：sigma公司;膏霜乳液、水劑、面膜、凝膠化妝品均為市售，標簽標識含大麻(CANNABIS SATIVA)葉提取物、大麻(CANNABIS SATIVA)籽油等大麻成分。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

圖1 4種組分高效液相色譜圖Fig.1 HPLC diagram of 4 components

色譜柱：AgilentZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL；檢測器：DAD檢測器，檢測波長220 nm及200～400 nm光譜掃描；以甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液(用乙酸調pH 6.0)(85:15)為流動相洗脫。此色譜條件下，4種組分分離良好，色譜圖見圖1所示。

1.3.2 供試品溶液的制備

取樣品約1.0 g，精密稱定，置于10 mL具塞比色管中，加入甲醇適量，渦旋振蕩30 s，使試樣與甲醇充分混勻；用甲醇定容至10 mL，超聲提取20 min,搖勻，取上清液過濾，即得。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

實驗選取了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液、甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液進行考察。當使用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，各組分分離度與峰型不佳；使用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液時，Alliance e2695-2998高效液相色譜儀在流動相平衡階段、LC-20A高效液相色譜儀在進樣階段易出現失壓現象；為避免上述情況的發生，故使用甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液作為流動相。流動相pH值的變化對Δ9-四氫大麻酚、大麻二酚和大麻酚的保留時間無顯著影響，但對Δ9-四氫大麻酚酸的保留時間影響較大，當pH值為4.0和5.0時，四氫大麻酚酸與其余組分不能完全分離，pH值為6.0時分離良好。

2.2 線性與檢出限、定量限

取1.2項下的各對照品溶液，用甲醇稀釋得標準系列溶液并進行測定。以目標峰峰面積為Y，質量濃度(μg/mL)為X繪制標準曲線；以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比確定定量限, 線性范圍、檢出限、定量限結果見表1所示。

表1 4種線性范圍、檢出限與定量限Table 1 Linear ranges, correlation conefficients, LODs, and LOQs of 4 components

2.3 加樣回收率試驗與精密度

選取不含大麻成分的膏霜乳液、水劑、面膜、凝膠化妝品空白樣品，分別添加濃度相當于約1、10倍LOQ的標準溶液，按2項下條件進行加標回收試驗，每個水平平行測定6次，4種組分在樣品中的平均加標回收率的范圍為87.3%～111.1%，精密度均小于9.6%，詳見表2所示。

表2 加標回收率試驗結果Table 2 Results of standard addition recovery

續表2

2.4 實際樣品測定

按本方法對11批標識含大麻成分的市售化妝品進行測定，結果4批樣品檢出大麻二酚，含量在0.04～1.5 mg/g之間；其余三種組分未檢出，詳見表3所示。

表3 樣品分析結果Table 3 Analytical results of samples

3 結 論

本文建立了適用于不同化妝品基質的Δ9-四氫大麻酚、大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚酸A的檢測方法，能夠基本覆蓋使用大麻提取物原料的主要化妝品類型，操作簡便、分離度好、靈敏度高、精密度良好，為監測化妝品中大麻類提取物的使用提供了技術參考。