井下煤礦工作不育患者的精子質(zhì)量及輔助生殖妊娠結(jié)局研究*

管福來 董業(yè)浩 曹井賀 梁魯南 劉貞輝 孫寶剛**

1.濰坊醫(yī)學院形態(tài)學實驗室(山東 濰坊 261053);2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院(山東 濟寧 272029)

濟寧作為傳統(tǒng)的煤礦產(chǎn)區(qū),在不孕不育日常診療過程中,從事井下工作的男性不育患者占有一定的比例,作為一種特殊的職業(yè)群體,煤礦工人的身心健康引起了社會和企業(yè)的關注,并進行了大量的研究工作[1-3]。 但此類工作與男性不育關系的研究較少,并且井下煤礦工作對體外受精-胚胎移植的治療結(jié)局的影響鮮有報道,基于以上研究背景,通過分析井下煤礦工作患者精液質(zhì)量及其精子功能、輔助生殖妊娠結(jié)局以及后代情況,探討井下煤礦工作對精液質(zhì)量、精子功能、輔助生殖妊娠結(jié)局以及出生后代的影響,為臨床上對此類患者進行生育能力評價、治療措施的選擇、妊娠結(jié)局的預測、對子代的影響等提供依據(jù)。

一、資料與方法

(一)研究對象

回顧分析濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心56例從事井下煤礦工作1 年以上、因妻子輸卵管因素行輔助生殖助孕男性患者作為實驗組,將103 例正常生育男性、因妻子輸卵管因素行輔助生殖助孕者作為對照組。 所有周期均為第一次治療周期,所有患者進行助孕治療前均經(jīng)過詳細的一般情況檢查、體格檢查、內(nèi)分泌檢查、遺傳學檢查和至少兩次精液分析。 對進入研究的對象嚴格篩選,排除以下因素:①具有嚴重生殖系統(tǒng)異常的患者;②女方存在其他不孕原因,發(fā)現(xiàn)已知的影響輔助生殖助孕妊娠結(jié)局的疾病,(其通過子宮輸卵管造影或者宮腔鏡、腹腔鏡手術以及超聲檢查證實);③男方存在遺傳性疾病;④伴有泌尿生殖系統(tǒng)外科疾病;⑤有特殊用藥史(如激素類、細胞毒藥物);⑥有特殊職業(yè)暴露史(如毒物、高強輻射、化工、農(nóng)藥、高溫、高濕等);⑦有不良生活史(如吸煙＞10 支/天、酗酒、電腦接觸＞8h/天等)。

(二)方法

1.精液常規(guī)分析

(1)計算機輔助精子分析(CASA):采用計算機輔助精子分析儀(西班牙,SCA)檢測精子密度、總數(shù)、各級運動精子百分率和數(shù)量等。

(2)精子形態(tài)學分析(Diff-Quik 法):精子形態(tài)畸形率=畸形精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%

2.精子功能檢查

依照WHO 技術規(guī)范采集、處理和檢測精液標本,檢測實驗組與對照組相關精子指標水平。 精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率;精子核蛋白不成熟率;精子DNA 碎片率。

(1)精子頂體酶活性檢測:使用精子頂體染色試劑盒(PSA-FITC,深圳華康生物)檢測精子頂體酶活性,簡要步驟如下:測定精液常規(guī)參數(shù)后,測定和對照Ep 管中加入7.5×106個精子,離心去除精漿,按照試劑盒使用說明操作,依次加入相關試劑,水浴后離心,紫外分光光度計讀取各管405nm 的OD 值,計算頂體酶活性。

(2)精子核蛋白組型檢測(苯胺藍染色法,深圳華康生物)利用洗滌液稀釋精子濃度至40×106/mL 對于小于該濃度的樣本進行離心濃縮)。 取上述調(diào)整后的精液1mL 加Eppendorf 管內(nèi),1000×g 離心10min,去除精漿。 加1mL 洗滌液,充分混勻。 1000×g 離心3min 去上清液,如此共洗滌3 次。 最后一次離心棄上清液后,加1mL 粘合液。 取5μl 調(diào)整后的精液涂片,空氣干燥。加固定液固定90s,甩去固定液。 玻片以自來水輕輕沖洗7 次,甩去玻片表面積水,加染液覆蓋膜片區(qū),染色5min。 以自來水緩緩沖洗,然后將膜片浸泡至洗脫液中準確脫色18 ～20min,或至膜片無明顯藍色為止。 立即甩去脫色液,以自來水快速洗滌7 次。 迅速吹干或晾干后加封固液1 滴,以蓋玻片封片。 油鏡計數(shù)200 個精子,不成熟核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常精子頭部呈藍色,計算頭部著色精子百分率。

(3)精子DNA 碎片檢測[精子染色質(zhì)擴散實驗(SCD)法,深圳博銳德生物科技有限公司]。 檢驗方法:①試劑及室溫準備:將易熔凝膠管置于80℃孵育20min,待完全融化后,將易熔凝膠管置于37℃待用。檢測前將室溫調(diào)整至20 ～28℃。 ②標本制備:將液化的新鮮精子濃度用生理鹽水調(diào)整至(5 ～10)×106/mL。③檢測方法:嚴格按照試劑盒使用說明給出的檢測方法進行檢測。 ④精子DNA 碎片判定標準:精子頭部僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈,單側(cè)光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。 SDF(%)= 存在DNA 碎片精子數(shù)/被觀察精子總數(shù)×100%。

(4)精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率檢測(深圳博銳德生物科技有限公司):將10μl 液化的精液加入透明質(zhì)酸包被的載玻片(測定孔)“T”孔中后待精液自然擴散到(對照孔)“C”蓋上蓋玻片孔;室溫放置10min 后,在400 倍顯微鏡下觀察精了與玻片上的透明質(zhì)酸結(jié)合情況,計數(shù)500 個活動精了,精了-透明質(zhì)酸結(jié)合率(%)=(“T”孔被結(jié)合精了數(shù)/“T”孔計數(shù)活動精了總數(shù)-“C”孔被結(jié)合精了數(shù)/“C”孔計數(shù)活動精了總數(shù))×100%。

3.臨床操作

(1)控制性超促排卵:實驗組與對照組女方均選擇長方案超促排卵:于啟周期前次月經(jīng)黃體中期肌注GnRH-α(促性腺激素釋放激素激動劑),達菲林1.33mg,月經(jīng)第3 天開始使用GnRH-α 促排卵,月經(jīng)第6 天起,行陰道B 超檢查卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況,并以此及時調(diào)整用藥。 直至有2 ～3 個主導卵泡直徑在18mm 以上時,結(jié)合激素檢測結(jié)果提示卵泡發(fā)育成熟,停用促排卵藥物,于當晚8 點注射hCG5000 ～10000u。注射hCG(人絨毛膜促性腺激素)后34 ～36 小時在陰道B 超引導下穿刺取卵,記錄取卵數(shù)。

4.胚胎實驗室操作

(1)精子處理:為了減少或者去除精漿的抗精子抗體,細菌,免疫活性細胞、雜質(zhì),達到符合要求的精子濃度,促進精子獲能,改善精子受精能力等,將實驗組與對照組在授精前須對精子進行必要的處理。 采用密度梯度分離法分離:其具體步驟為:取精子密度梯度分離培養(yǎng)基,吸取1mL 下層(高密度)分離培養(yǎng)基置于離心管中,再吸取1mL 上層分離培養(yǎng)基(低密度)緩慢地注于下層分離培養(yǎng)基的上面。 兩層培養(yǎng)基的中間形成一個清晰的界面,37℃培養(yǎng)箱復溫。 小心吸取1mL 培養(yǎng)基化的精液覆蓋于上層分離培養(yǎng)基的液面。 以(300 ～600)×g 的速度離心20min。 移去所有的分層溶液,只剩底部的沉淀。 加2 ～3mL 洗精培養(yǎng)基,將沉淀混勻。200×g 離心5min。 移去上清,再加入洗精培養(yǎng)基,重復離心洗滌步驟。 用0.5mlIVF 受精培養(yǎng)基沉淀。 進行精子計數(shù)和精子質(zhì)量評估。 將處理獲得的精子調(diào)整密度(50 ～300)×103/mL 為宜,后置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱待用。

(2)受精及胚胎培養(yǎng):實驗組、對照組采用常規(guī)的體外受精。 受精后18h 觀察原核,出現(xiàn)2 個原核和2 個極體為正常受精卵,未出現(xiàn)2PN 為受精完全失敗。 取卵后培養(yǎng)72h 觀察胚胎形態(tài),將優(yōu)質(zhì)胚胎移植到宮腔內(nèi)。 胚胎移植后14 天檢測尿或血HCG 陽性,移植后4 ～5周超聲檢查見胎心搏動為臨床妊娠。 移植時先選擇常規(guī)受精來源的胚胎,若無常規(guī)受精來源胚胎則移植ICSI 受精胚胎。

(3)胚胎按以下評分標準分級:

胚胎以形態(tài)學指標分級:4'-卵裂球大小均勻,碎片為≤5%;3'-卵裂球大小均勻或不等,碎片6% ～20%;2'-卵裂球體積相等或不等,碎片21% ～50%;1'-卵裂球少,碎片＞50%。 1、2 級胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)下列情況,胚胎評級時在形態(tài)學基礎上降一級:①授精20h 內(nèi)未見到原核,48h 證實為延遲受精的胚胎。 ②取卵后48h超過8 細胞或72h 未超過5 細胞。 正常受精4、3 級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

5.計算公式:受精率=正常受精卵數(shù)/卵-冠-丘復合體數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%;著床率=B 超觀察到的妊娠囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率= 臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%;生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/妊娠周期數(shù);流產(chǎn)率=孕28 周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù);早產(chǎn)率=發(fā)生妊娠≥28 足周至≤37 足周的早產(chǎn)分娩數(shù)/產(chǎn)婦總數(shù)×100%。

(三)統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析。 計量資料用±s表示,比較采用單項方差分析;計數(shù)資料用率(比值)表示,比較應用卡方檢驗。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義,P＜0.01 差異有顯著統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

(一)實驗組與正常組一般資料比較(表1)

比較實驗組與對照組患者:男、女方年齡、不孕年限、竇卵泡數(shù)、女方基礎FSH、LH、HCG 日E2、HCG 日子宮內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表1。

表1 實驗組與對照組一般資料比較

(二)比較實驗組與對照組患者精液質(zhì)量比較

實驗組與對照組相比,精液參數(shù)中,精液量、精液濃度無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 對照組前向運動率、精子活動率、正常形態(tài)率組高于實驗組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表2。

表2 實驗組與對照組患者精液質(zhì)量比較

(三)實驗組與對照組患者精液功能比較

對比實驗組及對照組精子功能指標發(fā)現(xiàn):實驗組頂體酶活性、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),實驗組的DNA 碎片、核蛋白組型高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表3。

表3 實驗組與對照組患者精液功能比較

(四)實驗組與對照組輔助生殖結(jié)局的比較

對照組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率高于實驗組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),實驗組的卵裂率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。(P＞0.05)。 見表4

表4 實驗組與對照組輔助生殖結(jié)局的比較

(五)實驗組與對照組輔助生殖子代的比較

實驗組的流產(chǎn)率、出生體重、早產(chǎn)率、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 見表5。

表5 實驗組與對照組輔助生殖子代的比較

討 論

煤礦工作生產(chǎn)過程中,可能會產(chǎn)生高溫、噪音,震動、煤塵和化學毒物等職業(yè)危害,同時可能對心理健康產(chǎn)生不利影響,高溫會引起睪丸內(nèi)環(huán)境、代謝、免疫反應及生精微循環(huán)的改變,從而引發(fā)睪丸生精障礙、精液質(zhì)量下降,最終導致男性不育,使精液質(zhì)量下降[4-5]。另有研究顯示[6-8]:長期暴露在噪音振動職業(yè)工作環(huán)境下的工人則表現(xiàn)為,精子活力降低,畸形率升高等男性不育的表現(xiàn)。 此外,長期接觸煤塵以及微量的有毒有害物質(zhì)和放射性物質(zhì)對男性生殖健康都會造成嚴重的影響[9]。 同時長期高強度的工作加之井下作業(yè)的復雜生產(chǎn)環(huán)境,其中存在的粉塵、噪聲、震動、高溫、高濕的生產(chǎn)組織方式和不良體位等職業(yè)危害因素也在很大程度上影響著煤礦井下作業(yè)人員的身心健康,使他們承受著巨大的心理壓力。 長期負性情緒可使機體內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)發(fā)生功能紊亂,可以導致性功能和生殖功能障礙,造成精子質(zhì)量下降,引發(fā)男性不育[10-11]。

本研究結(jié)果顯示,從事井下煤礦工作的不育患者的精液參數(shù)中,精液量、精子濃度與正常生育男性相比無統(tǒng)計學意義。 而從事煤礦的不育患者的前向運動精子率、精子活動率、正常形態(tài)率組高于實驗組,差異有統(tǒng)計學意義。 從事煤礦的不育患者的頂體酶活性、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義,實驗組的DNA 碎片、核蛋白組型大于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義;這與胡麗麗等的[12]研究相似。 這說明從事煤礦工作的工人長期受到高溫、噪音,震動、煤塵和化學毒物等多重不良因素的影響,對其男性生精功能會產(chǎn)生損傷,最終會導致男性不育的發(fā)生,具體表現(xiàn)在精子質(zhì)量的下降,精子功能的損傷等。

作為有可能導致男性不育的煤礦井下工作,目前關于其對體外受精-胚胎移植的治療結(jié)局的影響卻鮮有報道。 我們的研究顯示:從事井下煤礦工作的不育患者的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。 井下煤礦工作的不育患者的卵裂率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。井下煤礦工作的不育患者的子代影響指標與對照組相比。 實驗組的流產(chǎn)率、出生體重、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。 而導致井下煤礦工作的不育患者的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率低于正常生育的原因可能是由于精子質(zhì)量影響輔助生殖結(jié)局[13-14],而長期從事煤礦工作會導致患者精子活力下降,精子畸形率升高,可能影響精卵結(jié)合及胚胎質(zhì)量,從而導致受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率降低[15]。

我們研究發(fā)現(xiàn)井下煤礦工作對男性精液質(zhì)量、精子功能及輔助生殖結(jié)局都有一定的影響。 這需要從事煤礦工作人員應加強自我防范意識,同時煤礦企業(yè)也應加強對井下煤礦工人的勞動保護。 但由于本研究樣本偏少,結(jié)論可能具有一定局限性,還有待于大樣本隨機對照實驗證實。